產品名稱:：線粒體呼吸鏈復合體Ⅴ活性檢測試劑盒

產品英文名:  Mitochondrial Respiratory Chain ComplexⅤActivity Assay Kit

產品(pin)貨號：BC1440               產地：北京市通州區馬駒橋(qiao)聯東(dong)U谷8三樓

產品(pin)規格：50管/24樣           產品(pin)商標：solarbio
保(bao)(bao)存(cun)與(yu)運輸：4℃保(bao)(bao)存(cun)或-20℃保(bao)(bao)存(cun)；            參考(kao)價格：2600
庫(ku)存狀態：現貨(huo)                          
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簡要介紹：
線粒(li)體(ti)(ti)復(fu)合(he)(he)體(ti)(ti)Ⅴ又(you)稱F1F0-ATP合(he)(he)酶，廣泛存(cun)(cun)在于(yu)動物、植(zhi)物、微生(sheng)物和培養細胞的線粒(li)體(ti)(ti)中，由F1和F0兩個亞單位組成。該酶利(li)用呼吸(xi)鏈產生(sheng)的質子電(dian)化(hua)(hua)學梯度催化(hua)(hua)ATP合(he)(he)成，也可逆過程水解ATP。此外，復(fu)合(he)(he)體(ti)(ti)Ⅴ還存(cun)(cun)在于(yu)葉(xie)(xie)綠體(ti)(ti)、異養菌(jun)和光(guang)合(he)(he)細菌(jun)中。復(fu)合(he)(he)體(ti)(ti)Ⅴ是線粒(li)體(ti)(ti)氧化(hua)(hua)磷酸(suan)化(hua)(hua)和葉(xie)(xie)綠體(ti)(ti)光(guang)合(he)(he)磷酸(suan)化(hua)(hua)合(he)(he)成ATP的關鍵(jian)酶。
    復(fu)合體Ⅴ水解(jie)ATP 產生ADP 和Pi，通過(guo)測(ce)定(ding)Pi 增加速(su)率來測(ce)定(ding)復(fu)合體Ⅴ活性。


產品詳細描述
產品內容：
提取液：液體(ti)15mL×1瓶，4℃保存(cun)；
試劑一：液體15mL×1瓶，4℃保存；
試劑二(er)： 粉(fen)劑×1支(zhi)，-20℃保(bao)存(cun)；臨用(yong)前每支(zhi)加入1.11mL雙蒸水(shui)，充分溶解備用(yong)，分裝后-20℃保(bao)存(cun)，避免(mian)反(fan)復凍融；
試(shi)劑三：液體6mL×1瓶，4℃保存；
試(shi)劑四：粉(fen)劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入3mL雙蒸水，充分混勻；
試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加(jia)入10mL雙蒸水，充(chong)分混(hun)勻；
試劑(ji)六：粉劑(ji)×1瓶(ping)，4℃保(bao)存；臨用前加入10mL雙蒸(zheng)水(shui)，充分(fen)混勻；
試劑(ji)七：液體10mL×1 瓶(ping)，室溫保(bao)存(cun)。
標準品：液(ye)體(ti)1mL×1 支，4℃保(bao)存。10μmol/mL磷(lin)(lin)標準液(ye)。臨用前用蒸(zheng)餾水稀(xi)釋40倍即0.25μmol/mL 磷(lin)(lin)標準液(ye)。
定(ding)磷(lin)試(shi)劑(ji)的配制(zhi)：按H2O：試(shi)劑(ji)五(wu)：試(shi)劑(ji)六：試(shi)劑(ji)七=2:1:1:1 的比例配制(zhi)，配好的定(ding)磷(lin)試(shi)劑(ji)應為淺黃色(se)。若(ruo)無色(se)則試(shi)劑(ji)失(shi)效(xiao)，若(ruo)是藍色(se)則為磷(lin)污染（請根據需要(yao)，用多(duo)少(shao)配多(duo)少(shao)）。
注意：配試劑用新的燒杯、玻璃棒和玻璃移液器(qi)，或者一(yi)次性塑料器(qi)皿，以避免磷污染(ran)。
 
產品(pin)說明：
線粒體復合體Ⅴ又稱F₁F₀-ATP合酶，廣(guang)泛存在于(yu)動物(wu)、植物(wu)、微生(sheng)物(wu)和(he)培養(yang)(yang)細(xi)胞的線粒體(ti)中，由F1和(he)F0兩個(ge)亞單位組(zu)成。該酶利用呼吸鏈產生(sheng)的質(zhi)子電(dian)化學梯度催化ATP合成，也可逆過(guo)程水解ATP。此外，復合體(ti)Ⅴ還存在于(yu)葉綠體(ti)、異養(yang)(yang)菌和(he)光合細(xi)菌中。復合體(ti)Ⅴ是線粒體(ti)氧化磷(lin)酸化和(he)葉綠體(ti)光合磷(lin)酸化合成ATP的關鍵酶。
復(fu)合(he)(he)體Ⅴ水解ATP產生(sheng)ADP和Pi，通(tong)過(guo)測定Pi增加速率來測定復(fu)合(he)(he)體Ⅴ活(huo)性(xing)。
試驗(yan)中(zhong)所需(xu)的儀器和(he)試劑：
臺式(shi)離心機、可見(jian)分光光度計、水浴鍋、1mL玻璃比色皿、可調(diao)式(shi)移液槍、研缽(bo)/勻漿器(qi)、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、復合體Ⅴ的提取(qu)：   

• 稱取約0.1g組織或收(shou)集500萬細(xi)胞，加入1.0 mL提取液(ye)，用冰浴勻漿(jiang)器(qi)或研(yan)缽勻漿(jiang)。
• 4 ℃ 600 g離心10min。
• 將上清液移另一(yi)離(li)心管中，4 ℃ 11000 g離(li)心15min。
• 上清液即胞(bao)漿提取物，可用于測(ce)定從(cong)線(xian)粒體泄漏的復合體Ⅳ（此步可選(xuan)做，可以判斷線粒體(ti)提取效果(guo)）。
• 在沉淀中加入(ru)400uL提取液，超聲(sheng)波破(po)碎（功率(lv)20％，超聲(sheng)5秒(miao)，間隔10秒(miao)，重復15次），用(yong)于復合體Ⅳ酶活性測定，并且用于蛋白含量(liang)測定。

二、測(ce)定步驟：

1. 可見分光(guang)光(guang)度計預熱30min以(yi)上(shang)，調節波長660nm，蒸餾水調零。
2. 操作表：

（1）酶促反應

（2）定磷

混(hun)勻，40℃水浴(yu)10min，盡快在660nm測(ce)定吸光值，分別(bie)記為A測(ce)定管、A對(dui)照(zhao)管、A標準管，計(ji)算ΔA=A測(ce)定管-A對(dui)照(zhao)管。

三、復合體Ⅴ活力單位(wei)的計算：
單(dan)位(wei)的定義(yi)：每(mei)mg組織蛋白在反應體系中每(mei)分鐘產(chan)生1 nmol 無(wu)機磷定義(yi)為(wei)一個酶(mei)活性單(dan)位(wei)。
復合體Ⅴ活性（U/mg prot）=ΔA÷A標(biao)準×C標(biao)準×V酶促×1000÷（Cpr×V樣品）÷T
=20×ΔA÷A標準÷Cpr。
C標準(zhun)液(ye)：標準(zhun)溶液(ye)濃度，0.25μmol/mL； 1000：1μmol=1000nmol；Cpr：樣品(pin)蛋白濃度，mg/mL，需自(zi)行測定(ding)，推薦我公司BCA蛋白濃度測定(ding)試劑盒；V樣品(pin)：樣品(pin)體(ti)積，0.2mL；V酶(mei)促(cu)，酶(mei)促(cu)反應(ying)總體(ti)積，0.48mL；T：反應(ying)時間，30min。
注意事項(xiang)：

1. 為保證實驗(yan)結果(guo)的(de)準確性，需(xu)先取1-2個樣做預(yu)實驗(yan)，如果(guo)測定的(de)吸(xi)光值過高(gao)（高(gao)于(yu)1），可用蒸餾(liu)水(shui)稀釋上清液(ye)后(hou)再測定。計算結果(guo)時注意(yi)乘以稀釋倍數(shu)。若ΔA大于(yu)(yu)0.4，需(xu)將(jiang)樣本稀(xi)釋適當(dang)倍數(shu)（計算公式中乘以相應(ying)稀(xi)釋倍數(shu)），使A1-A2 小于(yu)(yu)0.2，可提(ti)高(gao)檢測靈(ling)敏度；若ΔA偏小，則可以通過增加(jia)加(jia)入的樣品體積來(lai)提(ti)高(gao)靈(ling)敏度。
2. 由于提取(qu)液(ye)中(zhong)含(han)有蛋白，所以在測定樣品蛋白濃(nong)度時需要減去提取(qu)液(ye)本(ben)身的(de)蛋白含(han)量（單獨(du)測量）。
3. 本試(shi)劑盒試(shi)劑足(zu)夠完(wan)成(cheng)50管反應。
4. 附(fu)：使用樣本重量計算(suan)公式：（檢測樣本數為50T/24S）

A、上清中復合體Ⅳ活力的計算：
按(an)樣(yang)本鮮(xian)重計算：
單(dan)位定義：每g組織在反(fan)應體系(xi)中每分鐘(zhong)催化降解1nmol還原型細胞色素C定義為一個(ge)酶活力單(dan)位。
復合體Ⅳ活力(U/g)=[ΔA1×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W÷V提取×V樣(yang))÷T=1099×ΔA1÷W
ΔA1：上清測定(ding)值；V 反總：反應體系總體積(ji)，8.4×10^-4 L；ε：細胞色素(su)C摩爾消光系數，1.91×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿(min)光徑(jing)，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.04 mL；V提取：加(jia)入提取液(ye)體(ti)積，1.0mL。 w：樣本重量(liang)，g。T：反(fan)應時(shi)間，1 min；
B、沉淀中復合體Ⅳ活(huo)力的計算：
按樣本鮮重計(ji)算：
單位定(ding)義(yi)(yi)：每g組織在(zai)反應體系中每分鐘催化降解(jie)1nmol還原型(xing)細胞(bao)色(se)素C定(ding)義(yi)(yi)為一個(ge)酶(mei)活力(li)單位。
復合體Ⅳ活力(U/g)=[ΔA2×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W÷V提取(qu)×V樣(yang))÷T=440×ΔA2÷W
ΔA2：沉(chen)淀測(ce)定值；V 反總(zong)：反應體系總(zong)體積，8.4×10^-4 L；ε：細(xi)胞色(se)素C摩(mo)爾(er)消光系數，1.91×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿(min)光徑，1cm；V 樣：加入樣本體(ti)積，0.04 mL；V提(ti)取(qu)：加入(ru)提(ti)取(qu)液體積，0.4mL。 w：樣(yang)本(ben)重量，g。T：反應時(shi)間，1 min；
C、樣本復(fu)合體(ti)Ⅳ總活力的計算：
樣本(ben)復(fu)合體Ⅳ總活力即(ji)為上清中(zhong)復合體(ti)Ⅳ活(huo)力與沉淀(dian)中復合體Ⅳ活力之(zhi)和。
按樣本鮮重計算：
復合體Ⅳ（U/g）=1099×ΔA1÷W+440×ΔA2÷W

相關文獻：
《A Damaged Oxidative Phosphorylation Mechanism Is Involved in the Antifungal Activity of Citral against Penicillium digitatum》 作者:Qiuli OuYang, Nengguo Tao* and Miaoling Zhang 期刊:Frontier in Immunology 影響因子:4.259 PMID:29503638
《Roles of TRPA1 and TRPV1 in cigarette smoke -induced airway epithelial cell injury model》 作者:Muyun Wang,Yanbei Zhang,Mengmeng Xu,HaiZhang,Yuqing Chen,Kian Fan Chung,Ian M.Adcock,Feng Li 期刊:Free Radic. Biol. Med. 影響因子:5.657 PMID:30639616


 

線粒體呼吸鏈復合體Ⅴ活性檢測試劑盒