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Human IL-8人白細胞介素8ELISA試劑盒
產品編號：SEKH-0016
適用于人血清、血漿或細胞培養上清液等樣本

背景介紹：
      白細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)介素 8(IL-8)為趨化(hua)因(yin)子(zi)超家(jia)族中的(de)一員。人類 IL-8 的(de) cDNA 序列含(han)(han) 99 個氨基(ji)酸殘基(ji)，含(han)(han) 4 個 Cys，無 N 糖基(ji)化(hua)位(wei)點，IP8.0～8.5，分(fen)子(zi)量(liang)為 8.3kD，耐熱、耐堿(jian)、耐胰蛋白酶，但對巰基(ji)化(hua)合物(wu)敏感。單 核細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)、巨(ju)噬(shi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)、內皮(pi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)、多形核白細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(PMN)、成纖維細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)、Ⅰ型上(shang)皮(pi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)及支(zhi)氣管上(shang)皮(pi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)等均能 產生(sheng) IL-8，在肺部可能以巨(ju)噬(shi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)為主。IL-8 是(shi)由單核/巨(ju)噬(shi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)產生(sheng)的(de)單核因(yin)子(zi)，對中性(xing)粒(li)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)、T 淋巴 細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)、嗜堿(jian)性(xing)粒(li)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)具有趨化(hua)作用，能夠調(diao)節 T、B 淋巴細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)成熟分(fen)化(hua)的(de)激素樣分(fen)子(zi)，在炎癥反應、免疫(yi)調(diao) 節中起重要作用。

Human IL-8人白細胞介素8ELISA試劑盒

檢測原理：
      Solarbio (Solarbio ®) ELISA 試(shi)劑盒采用基于雙抗體夾心法的(de)(de)酶(mei)(mei)聯免疫吸附(fu)檢測技術。將抗人 IL-8 單克(ke)隆抗體包(bao)(bao)被(bei)在酶(mei)(mei)標(biao)(biao)(biao)板(ban)(ban)上(shang)；分(fen)別加入(ru)梯(ti)度稀(xi)(xi)釋(shi)的(de)(de)標(biao)(biao)(biao)準品(pin)和(he)(he)預(yu)稀(xi)(xi)釋(shi)的(de)(de)樣(yang)本(ben)，標(biao)(biao)(biao)準品(pin)和(he)(he)樣(yang)本(ben)中(zhong)(zhong)的(de)(de)人 IL-8 會與酶(mei)(mei)標(biao)(biao)(biao) 板(ban)(ban)上(shang)的(de)(de)包(bao)(bao)被(bei)抗體充分(fen)結合；洗板(ban)(ban)后(hou)加入(ru)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)化抗人 IL-8 抗體，該抗體會與板(ban)(ban)子上(shang)包(bao)(bao)被(bei)抗體捕獲的(de)(de)標(biao)(biao)(biao)準品(pin) 和(he)(he)樣(yang)本(ben)中(zhong)(zhong)的(de)(de)人 IL-8 發(fa)生(sheng)(sheng)特異性(xing)結合；洗板(ban)(ban)后(hou)加入(ru)辣根過氧化物(wu)(wu)(wu)酶(mei)(mei)（HRP）標(biao)(biao)(biao)記的(de)(de)鏈霉親(qin)和(he)(he)素(su)，生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)與鏈 霉親(qin)和(he)(he)素(su)會發(fa)生(sheng)(sheng)高強度的(de)(de)非共價(jia)結合；洗板(ban)(ban)后(hou)加入(ru)顯色(se)劑底(di)物(wu)(wu)(wu) TMB，若反(fan)應孔中(zhong)(zhong)樣(yang)品(pin)存在不(bu)同濃(nong)度的(de)(de)人 IL-8， 則(ze) HRP 會使無色(se) TMB 變(bian)成(cheng)(cheng)不(bu)同深淺（正(zheng)相關）的(de)(de)藍色(se)物(wu)(wu)(wu)質(zhi)，加入(ru)終止液后(hou)反(fan)應孔會變(bian)成(cheng)(cheng)黃色(se)；后(hou)，在 λmax=450 nm（OD=450 nm）處(chu)測定反(fan)應孔樣(yang)品(pin)吸光度（OD），樣(yang)本(ben)中(zhong)(zhong)的(de)(de)人 IL-8 濃(nong)度與 OD 成(cheng)(cheng)正(zheng)比，通過 繪制(zhi)標(biao)(biao)(biao)準曲線和(he)(he)四參數擬合軟(ruan)件便(bian)可計(ji)算出(chu)樣(yang)本(ben)中(zhong)(zhong)人 IL-8 的(de)(de)濃(nong)度。

原理圖：

注意事項：
1. 試劑盒應在有效期內使用，請不要使用過期的試劑。
2. 試劑盒未使用時應保存在 2-8℃冰箱，已復溶但未用完的標準品，請丟棄。
3. 試劑盒使用前請在室溫恢復 30 min，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品。
4. 在試驗中標準品和樣本建議作復孔檢測，且加入試劑的順序應保持*。
5. 為避免交(jiao)叉污染(ran)，請在(zai)試驗中使用 1 次性試管，槍(qiang)頭，封板膜(mo)（※）及潔凈塑料容器。

6. 濃縮生物素化抗體和濃縮酶結合物的體積較少，在運輸過程中微量液體會沾到管壁及瓶蓋上，使用前請離心處理（5-10 S 即可），使管壁上的液體集中在管底部，取用時，請用移液器小心吹打幾次。
7. 除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外，請不要使用其他來源試劑盒內含的試劑代替本試劑盒中的某單個組分。
8. 為保證(zheng)結果(guo)準(zhun)確(que)，每次(ci)檢(jian)測(ce)均需做標準(zhun)曲線。

安全提示：
試劑盒中的終止液為酸性溶液，操作人員在使用時請帶上手套并注意防護；在操作過程中也要避免試
劑接觸皮膚和眼睛，如果不慎接觸，請用大量清水清洗；檢測血液樣本及其它體液樣本時，請按國家生物
實驗室安全防(fang)護有關管(guan)理規定執(zhi)行(xing)。

自備實驗器材（不提供，可代購）
1． 酶標儀（主波長 450nm，參考波長 630nm）
2． 高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl
3． 洗板機或洗瓶
4． 37℃孵育箱
5． 雙蒸水，去離子水，量筒等
6． 稀釋用聚丙烯試管

樣本收集及儲存：
1. 細胞培養上清：
將細胞培養基移無菌離心管，在 4℃條件下 1000 ×g 離心 10 min,然后將上清等量分裝于小 EP 管于-20℃下保存（24 小時內檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復凍融。
2. 血清樣本：
室溫血液自然凝固 20 min 后，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于
-20℃下保存（24 小時內檢測可放入 2-8℃儲存），保存過程中如有沉淀，請再次離心，避免反復凍融。
3. 血漿樣本：
將全血收集到含抗血凝劑的管中，根據標本的實際要求選擇 EDTA，檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合 20 min ，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24小時內檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復凍融。
※注意：血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本，以免影響檢測結果；如果樣本中的靶標物檢測濃度高
于(yu)標準品的值，請將樣品做適當倍數(shu)稀釋(shi)后檢測，建議正式實驗(yan)前做預實驗(yan)以確定稀釋(shi)倍數(shu)。

試劑準備：
1. 試劑回溫：先在實驗前 30 min 將試劑盒，待測樣本放置于室溫下，濃縮洗滌液如出現結晶，請放入
37℃溫浴直到結晶全部溶解。
2. 配制洗滌液：預先計算好稀釋后的洗滌液使用體積，然后用雙蒸水或去離子水將 20 倍濃縮洗滌液稀釋成 1 倍應用液，未用完的濃縮洗滌液放入 4℃冰箱保存。
3. 標(biao)(biao)準品(pin)(pin)梯度(du)稀(xi)(xi)釋(shi)：加(jia)入(ru)(ru)標(biao)(biao)準品(pin)(pin)/樣本(ben)稀(xi)(xi)釋(shi)液（SR1）1ml凍(dong)干標(biao)(biao)準品(pin)(pin)中，靜置15分鐘待其(qi)*溶(rong)解后(hou)輕 輕混(hun)勻(濃度(du)為(wei)1000pg/ml)，然后(hou)在濃度(du)為(wei)400pg/ml的(de)(de)EP管(guan)中加(jia)入(ru)(ru)600?1?71?1?778?1?71?1?776L標(biao)(biao)準品(pin)(pin)/樣本(ben)稀(xi)(xi)釋(shi)液（SR1），再 加(jia)入(ru)(ru)400?1?71?1?778?1?71?1?776L 1000pg/ml標(biao)(biao)準品(pin)(pin)原液，以(yi)獲得標(biao)(biao)準曲線(xian)(xian)的(de)(de)濃度(du)400pg/ml。后(hou)，在其(qi)余六管(guan)中各加(jia)入(ru)(ru) 500?1?71?1?778?1?71?1?776L標(biao)(biao)準品(pin)(pin)/樣本(ben)稀(xi)(xi)釋(shi)液（SR1），按照(zhao)以(yi)下濃度(du)進行2倍稀(xi)(xi)釋(shi)：200、100、50、25、12.5、6.25pg/ml 進行稀(xi)(xi)釋(shi)。標(biao)(biao)準品(pin)(pin)/樣本(ben)稀(xi)(xi)釋(shi)液（SR1）作為(wei)標(biao)(biao)準曲線(xian)(xian)的(de)(de)零點（0pg/ml）。復溶(rong)過(guo)的(de)(de)標(biao)(biao)準品(pin)(pin)原液（1000pg/ml） 未用完的(de)(de)應廢棄或根據(ju)需要按照(zhao)一次用量(liang)分裝(zhuang)，并將其(qi)貯存(cun)在-20～-80℃冰箱，具體如下圖。

4. 生物素化抗體工作液：預先(xian)計算好試驗所需用量，用檢測稀(xi)釋液（SR2）將100倍抗體濃縮(suo)液稀(xi)釋成(cheng)1倍

應用(yong)工作(zuo)液（稀釋前充(chong)分混勻），請在30分鐘內加入到反(fan)應孔中。

5. 酶結(jie)合物(wu)工作液(ye)：按每(mei)次試驗所需用(yong)量配制，用(yong)酶結(jie)合物(wu)稀釋液(ye)（SR3）將100倍(bei)濃縮酶結(jie)合物(wu)稀釋成1 倍(bei)應用(yong)工作液(ye)（稀釋前離(li)心(xin)），請(qing)在30分鐘內使用(yong)。

6. 洗(xi)滌方法： 

自動(dong)洗(xi)板：甩盡酶標板孔中(zhong)液體，在厚迭吸水紙上拍干，注(zhu)入洗(xi)滌液為 300ul/孔,注(zhu) 與吸出(chu)間隔為 30 秒，洗(xi)板 5 次。 

手工洗(xi)(xi)板(ban)：甩盡酶標板(ban)孔(kong)(kong)中液體，在厚(hou)(hou)迭吸水紙上(shang)拍干，用洗(xi)(xi)瓶加入洗(xi)(xi)滌液 300ul/孔(kong)(kong)，靜止 30 秒后甩 凈酶標板(ban)孔(kong)(kong)中液體，在厚(hou)(hou)迭的吸水紙上(shang)拍干，洗(xi)(xi)板(ban) 5 次。

結果判斷：

1.用酶標儀 450 nm 波長(chang)測定(ding) OD 值。選擇雙波長(chang)檢(jian)測，參考(kao)波長(chang)為 630 nm。如不能進行雙波長(chang)檢(jian)測，請(qing) 用 450 nm 的 OD 測定(ding)值減去 630 nm 的 OD 測定(ding)值。

2.計算(suan)標準品(pin)、樣品(pin)的平(ping)均(jun) OD 值：每個標準品(pin)和(he)標本的 OD 值應減去(qu)零孔的 OD 值

3.以(yi)標準(zhun)品濃度(du)為橫坐標，吸光度(du)OD值(zhi)為縱坐標，用軟件(jian)繪(hui)制標準(zhun)曲(qu)線，樣品中(zhong)IL-8含量可通過對應(ying)OD 值(zhi)由標準(zhun)曲(qu)線換算出相(xiang)應(ying)的濃度(du)。

4.若(ruo)標(biao)本(ben) OD 值高(gao)于(yu)標(biao)準曲(qu)線上限，應做(zuo)適當稀(xi)釋后重新檢測，計算濃度時再乘以稀(xi)釋倍數。

1. 數據及標準曲線

本圖僅供參考，應以當次試驗標準品繪制的標準曲線計算人 IL-8 的樣本含量

 

2. 靈敏度：
低可檢測人 IL-8濃度達 3pg/ml，
20 個零(ling)標(biao)(biao)準品濃度 OD 的平(ping)均值(zhi)加(jia)上兩個標(biao)(biao)準差，計算相應的可檢測濃度。

3. 特異性：
不與人 GROα、GROβ、IP-10、MIP-1α、MCP-1、RANTES 反應(ying)，小鼠 KC、MIG、SDF-1 等(deng)反應(ying)。

4. 重復性：
板內(nei)，板間變異系數<10%。

5. 回收率：
在選取的健康人(ren)血漿、細胞培養上(shang)清中加入 3 個不(bu)同濃度水平的人(ren) IL-8，計算(suan)回收率(lv)。

6. 線性稀釋：

分別在選(xuan)取的 4 份健康人血(xue)漿和細胞(bao)培養上(shang)清中加入高濃度人 IL-8，在標(biao)準(zhun)曲線動力(li)學范圍內進行(xing)稀 釋，評估(gu)線性。