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人白細胞介素6ELISA 試劑盒
產品編號：SEKH-0013
適用于人血清、血漿或細胞培養上清液等樣本

Human IL-6 elisa試劑盒

Human IL-6 elisa試劑盒

背景介紹：
     白細胞(bao)介素 6(IL-6)是一種(zhong)由(you)淋(lin)巴、非(fei)淋(lin)巴細胞(bao)產生(sheng)的多(duo)(duo)功能細胞(bao)因(yin)子(zi)。人 IL-6 的 cDNA 序列有(you) 212 個 氨(an)基(ji)(ji)(ji)酸(suan)殘(can)(can)基(ji)(ji)(ji)，含兩(liang)個潛(qian)在的 N -糖基(ji)(ji)(ji)化(hua)位點。成(cheng)熟(shu) IL-6 由(you)疏水 N 末端 28 個氨(an)基(ji)(ji)(ji)酸(suan)殘(can)(can)基(ji)(ji)(ji)信號肽裂解產生(sheng)，含 184 氨(an)基(ji)(ji)(ji)酸(suan)殘(can)(can)基(ji)(ji)(ji)，其(qi)(qi)中有(you)四個半胱氨(an)酸(suan)殘(can)(can)基(ji)(ji)(ji)，分(fen)子(zi)量為 21 kDa。IL-6 由(you)多(duo)(duo)種(zhong)細胞(bao)產生(sheng)，對免疫應答(da)(da)、急性(xing) 期(qi)反應、造(zao)血和(he)神經(jing)(jing)系(xi)統有(you)多(duo)(duo)方面作用。IL-6 的生(sheng)物學活性(xing)主要包括 6 個方面：調節(jie)(jie)免疫應答(da)(da)、調節(jie)(jie)造(zao)血 系(xi)統、誘導急性(xing)期(qi)蛋白、調節(jie)(jie)腫瘤(liu)生(sheng)長(chang)、調節(jie)(jie)神經(jing)(jing)內分(fen)泌系(xi)統和(he)其(qi)(qi)它(ta)。

檢測原理：
      Solarbio (Solarbio ®) ELISA 試劑(ji)盒(he)采用基(ji)于雙(shuang)抗(kang)(kang)體(ti)夾心(xin)法的(de)(de)酶(mei)聯免疫吸附(fu)檢測技(ji)術(shu)。將抗(kang)(kang)人 IL-6 單克 隆抗(kang)(kang)體(ti)包被在酶(mei)標(biao)板(ban)(ban)上；分別加(jia)入梯(ti)度(du)(du)稀釋的(de)(de)標(biao)準(zhun)(zhun)品(pin)和(he)(he)(he)(he)預稀釋的(de)(de)樣(yang)本，標(biao)準(zhun)(zhun)品(pin)和(he)(he)(he)(he)樣(yang)本中(zhong)的(de)(de)人 IL-6 會與(yu)酶(mei)標(biao) 板(ban)(ban)上的(de)(de)包被抗(kang)(kang)體(ti)充分結合(he)；洗板(ban)(ban)后加(jia)入生物(wu)素(su)化(hua)抗(kang)(kang)人 IL-6 抗(kang)(kang)體(ti)，該抗(kang)(kang)體(ti)會與(yu)板(ban)(ban)子上包被抗(kang)(kang)體(ti)捕獲(huo)的(de)(de)標(biao)準(zhun)(zhun)品(pin) 和(he)(he)(he)(he)樣(yang)本中(zhong)的(de)(de)人 IL-6 發(fa)生特異性(xing)結合(he)；洗板(ban)(ban)后加(jia)入辣根過(guo)氧化(hua)物(wu)酶(mei)（HRP）標(biao)記的(de)(de)鏈(lian)霉親和(he)(he)(he)(he)素(su)，生物(wu)素(su)與(yu)鏈(lian) 霉親和(he)(he)(he)(he)素(su)會發(fa)生高強度(du)(du)的(de)(de)非共價結合(he)；洗板(ban)(ban)后加(jia)入顯(xian)色劑(ji)底物(wu) TMB，若反應孔中(zhong)樣(yang)品(pin)存在不同(tong)濃(nong)(nong)度(du)(du)的(de)(de)人 IL-6， 則(ze) HRP 會使無色 TMB 變成不同(tong)深(shen)淺(qian)（正相關(guan)）的(de)(de)藍色物(wu)質，加(jia)入終(zhong)止(zhi)液后反應孔會變成黃色；后，在 λmax=450 nm（OD=450 nm）處測定反應孔樣(yang)品(pin)吸光(guang)度(du)(du)（OD），樣(yang)本中(zhong)的(de)(de)人 IL-6 濃(nong)(nong)度(du)(du)與(yu) OD 成正比，通過(guo) 繪(hui)制標(biao)準(zhun)(zhun)曲線和(he)(he)(he)(he)四參數擬合(he)軟件便可計算(suan)出(chu)樣(yang)本中(zhong)人 IL-6 的(de)(de)濃(nong)(nong)度(du)(du)。

原理圖：

注意事項：
1. 試劑盒應在有效期內使用，請不要使用過期的試劑。
2. 試劑盒未使用時應保存在 2-8℃冰箱，已復溶但未用完的標準品，請丟棄。
3. 試劑盒使用前請在室溫恢復 30 min，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品。
4. 在試驗中標準品和樣本建議作復孔檢測，且加入試劑的順序應保持*。
5. 為避免交叉污染，請在試(shi)驗中使用(yong) 1 次性試(shi)管，槍(qiang)頭，封板膜（※）及(ji)潔凈塑(su)料容器。

6. 濃縮生物素化抗體和濃縮酶結合物的體積較少，在運輸過程中微量液體會沾到管壁及瓶蓋上，使用前請離心處理（5-10 S 即可），使管壁上的液體集中在管底部，取用時，請用移液器小心吹打幾次。
7. 除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外，請不要使用其他來源試劑盒內含的試劑代替本試劑盒中的某單個組分。
8. 為(wei)保證結果準確，每次檢測均需做標(biao)準曲線(xian)。

安全提示：
試劑盒中的終止液為酸性溶液，操作人員在使用時請帶上手套并注意防護；在操作過程中也要避免試
劑接觸皮膚和眼睛，如果不慎接觸，請用大量清水清洗；檢測血液樣本及其它體液樣本時，請按國家生物
實驗室安全防護有(you)關管理規定(ding)執(zhi)行。

自備實驗器材（不提供，可代購）
1． 酶標儀（主波長 450nm，參考波長 630nm）
2． 高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl
3． 洗板機或洗瓶
4． 37℃孵育箱
5． 雙蒸水，去離子水，量筒等
6． 稀(xi)釋(shi)用聚丙烯試管

樣本收集及儲存：
1. 細胞培養上清：
將細胞培養基移無菌離心管，在 4℃條件下 1000 ×g 離心 10 min,然后將上清等量分裝于小 EP 管于-20℃下保存（24 小時內檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復凍融。
2. 血清樣本：
室溫血液自然凝固 20 min 后，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于
-20℃下保存（24 小時內檢測可放入 2-8℃儲存），保存過程中如有沉淀，請再次離心，避免反復凍融。
3. 血漿樣本：
將全血收集到含抗血凝劑的管中，根據標本的實際要求選擇 EDTA，檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合 20 min ，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24小時內檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復凍融。
※注意：血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本，以免影響檢測結果；如果樣本中的靶標物檢測濃度高
于標準品的值，請將樣品做適當倍數(shu)稀(xi)釋(shi)后檢測，建(jian)議正式實驗前做預實驗以確定稀(xi)釋(shi)倍數(shu)。

試劑準備：
1. 試劑回溫：先在實驗前 30 min 將試劑盒，待測樣本放置于室溫下，濃縮洗滌液如出現結晶，請放入
37℃溫浴直到結晶全部溶解。
2. 配制洗滌液：預先計算好稀釋后的洗滌液使用體積，然后用雙蒸水或去離子水將 20 倍濃縮洗滌液稀釋成 1 倍應用液，未用完的濃縮洗滌液放入 4℃冰箱保存。
3. 標(biao)(biao)(biao)準(zhun)品(pin)(pin)梯(ti)度稀(xi)(xi)釋(shi)(shi)：加入(ru)標(biao)(biao)(biao)準(zhun)品(pin)(pin)/樣本稀(xi)(xi)釋(shi)(shi)液(ye)（SR1）1ml凍干標(biao)(biao)(biao)準(zhun)品(pin)(pin)中，靜置15分鐘(zhong)待其(qi)*溶(rong)(rong)解后輕(qing) 輕(qing)混勻(濃(nong)(nong)度為1000pg/ml)，然后在(zai)其(qi)余七管中各加入(ru)500?1?78?1?76L標(biao)(biao)(biao)準(zhun)品(pin)(pin)/樣本稀(xi)(xi)釋(shi)(shi)液(ye)（SR1），按(an)照以下濃(nong)(nong)度 進行(xing)2倍稀(xi)(xi)釋(shi)(shi)：500、250、125、62.5、31.25、15.62、7.81 pg/ml進行(xing)稀(xi)(xi)釋(shi)(shi)。500pg/ml為標(biao)(biao)(biao)準(zhun)曲線點(dian) 濃(nong)(nong)度，標(biao)(biao)(biao)準(zhun)品(pin)(pin)/樣本稀(xi)(xi)釋(shi)(shi)液(ye)（SR1）作(zuo)為標(biao)(biao)(biao)準(zhun)曲線的(de)零點(dian)（0pg/ml）。復溶(rong)(rong)過的(de)標(biao)(biao)(biao)準(zhun)品(pin)(pin)原液(ye)（1000pg/ml） 未(wei)用完(wan)的(de)應廢棄或(huo)根據需要(yao)按(an)照一(yi)次用量分裝，并將其(qi)貯存在(zai)-20～-80℃冰(bing)箱，具體如下圖。

4. 生物素化抗體工作液：預先計算好試驗所需(xu)用量，用檢(jian)測稀釋(shi)液（SR2）將100倍抗體濃縮液稀釋(shi)成(cheng)1倍

應用工作液（稀釋前充分(fen)混勻），請在30分(fen)鐘內加入到反應孔中。

5. 酶(mei)(mei)結(jie)合物工作液(ye)(ye)：按每次試驗所需用(yong)量配制，用(yong)酶(mei)(mei)結(jie)合物稀釋(shi)(shi)液(ye)(ye)（SR3）將100倍濃(nong)縮酶(mei)(mei)結(jie)合物稀釋(shi)(shi)成1 倍應用(yong)工作液(ye)(ye)（稀釋(shi)(shi)前離心(xin)），請在30分(fen)鐘內使用(yong)。

6. 洗滌方法(fa)： 

自(zi)動洗板(ban)：甩盡(jin)酶標板(ban)孔(kong)中(zhong)液體，在厚迭(die)吸水紙(zhi)上拍干，注入洗滌液為 300ul/孔(kong),注 與吸出間隔為 30 秒，洗板(ban) 5 次。 

手(shou)工洗(xi)板：甩(shuai)盡酶(mei)標板孔中(zhong)液(ye)體，在厚迭吸(xi)水紙上拍(pai)干，用(yong)洗(xi)瓶加入洗(xi)滌液(ye) 300ul/孔，靜(jing)止 30 秒后甩(shuai) 凈酶(mei)標板孔中(zhong)液(ye)體，在厚迭的吸(xi)水紙上拍(pai)干，洗(xi)板 5 次。

結果判斷：

1.用酶標儀 450 nm 波長(chang)(chang)測(ce)(ce)定 OD 值。選擇雙波長(chang)(chang)檢測(ce)(ce)，參(can)考波長(chang)(chang)為 630 nm。如不(bu)能進行雙波長(chang)(chang)檢測(ce)(ce)，請 用 450 nm 的(de) OD 測(ce)(ce)定值減去 630 nm 的(de) OD 測(ce)(ce)定值。

2.計算標準品、樣品的(de)(de)平(ping)均 OD 值(zhi)：每個標準品和標本的(de)(de) OD 值(zhi)應減去(qu)零孔的(de)(de) OD 值(zhi)

3.以標(biao)準(zhun)(zhun)品濃(nong)度(du)為(wei)橫(heng)坐(zuo)標(biao)，吸光度(du)OD值為(wei)縱坐(zuo)標(biao)，用軟(ruan)件(jian)繪(hui)制標(biao)準(zhun)(zhun)曲(qu)線，樣品中IL-6含量可通過(guo)對(dui)應(ying)OD 值由標(biao)準(zhun)(zhun)曲(qu)線換算出(chu)相(xiang)應(ying)的濃(nong)度(du)。

4.若標本 OD 值高于標準曲線(xian)上限，應做適當稀(xi)(xi)釋(shi)后重(zhong)新檢測，計算濃度時再乘以稀(xi)(xi)釋(shi)倍數。

1. 數據及標準曲線

本圖僅供參考，應以當次試驗標準品繪制的標準曲線計算人 IL-6 的樣本含量

 

2. 靈敏度：
低可檢測人 IL-6 濃度達 4pg/ml，
20 個零標準品濃度(du) OD 的平均值加上兩個標準差(cha)，計算相應(ying)的可檢測(ce)濃度(du)。

3. 特異性：
不與人 IL-6 sR、IL-9、IL-10 反應，小鼠 IL-6、IL-10、IL-11、IL-12 等反應。

4. 重復性：
板內，板間變(bian)異系數(shu)<10%。

5. 回收率：
在選(xuan)取的健康人血(xue)漿、細胞(bao)培養上清(qing)中加(jia)入 3 個不同濃度水平的人 IL-6，計算回收率。

6. 線性稀釋：

分別在(zai)選取的 4 份(fen)健康人血漿和細胞培養(yang)上清中加(jia)入(ru)高濃(nong)度人 IL-6，在(zai)標準曲線(xian)動力學范(fan)圍內(nei)進(jin)行稀 釋，評(ping)估線(xian)性。