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丙酮酸脫氫酶(PDH)活性檢測試劑盒

注意：正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定。

貨號: BC0380

規格: 50T/48S

產品內容：

試劑一(yi)：液體60mL×1 瓶，4℃保(bao)存；

試劑二：液體1mL×1 支，-20℃避光保存；

試劑三：液體 50mL×1 瓶，4℃保存；

試(shi)劑(ji)四：粉劑(ji)×1 支(zhi)，4℃保(bao)存；

試劑五：粉劑×1 支，-20℃保存；

試劑六：粉劑×1 支(zhi)，4℃保存；

試(shi)劑七：粉劑×1 支，4℃保(bao)存(cun)；

工作液的配制：臨用前把試劑四、五、六、七轉移到試劑三中混合溶解待用；用不完的試劑 4℃保存一周。

產品說明：

     PDH（EC 4.1.1.1）廣泛(fan)存在于動物、植物、微生(sheng)物和培養細胞中(zhong)，是丙(bing)(bing)酮(tong)酸(suan)脫(tuo)氫酶復合體(PDHC)催化丙(bing)(bing)酮(tong)酸(suan)氧(yang)化脫(tuo)羧(suo)的限速酶，催化丙(bing)(bing)酮(tong)酸(suan)脫(tuo)梭(suo)生(sheng)成羥乙(yi)基(ji)-TPP，把糖酵解和三羧(suo)酸(suan)循環連接起來。PDH催化丙(bing)(bing)酮(tong)酸(suan)脫(tuo)氫，同(tong)時還(huan)原2,6-二(er)氯酚靛酚（2,6-DCPIP），從而(er)導致605nm光吸(xi)收的減少。

需自備的儀器和用品：

     可見分光(guang)光(guang)度計、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液(ye)器、1mL 比色皿、研缽、冰和(he)蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本的處理

    稱取約 0.1g 組(zu)織或收集 500 萬細(xi)胞(bao)，加入(ru)1mL 試劑(ji)(ji)一和 10μL試劑(ji)(ji)二，用冰浴(yu)勻(yun)漿器或研缽勻(yun)漿充分(fen)研磨(mo)，4 ℃ 11000 g離心10min，取上(shang)清，置冰上(shang)待測。

二、測定步驟

     1、分光光度(du)計(ji)預熱 30min以上，調(diao)節波長 605nm，蒸(zheng)餾水調(diao)零。

     2、每(mei)個(ge)樣(yang)本需要900μL工作液(ye)，按樣(yang)本數加一取出一定量的(de)工作液(ye)于37℃（哺乳動(dong)物）或25℃（其(qi)他物種）中孵育5min。

     3、空(kong)白管：在1mL比色皿中加(jia)入900 µL工(gong)作液和50µL水，混勻，立即記錄605nm處初始吸光(guang)值A1和1min后(hou)的吸光(guang)值A2，計算(suan) ΔA空(kong)白=A1-A2。

     ;4、測(ce)定管：在(zai)1mL 比色皿中加入900 µL工(gong)作液和50µL樣(yang)本，混勻，立即記錄 605nm 處(chu)初始吸光(guang)值A3和1min后的吸光(guang)值A4，計算ΔA測(ce)定=A3-A4。

三、PDH 活性計算

    （1） 按(an)樣(yang)本蛋白濃度計算

     單(dan)位(wei)的(de)定(ding)義(yi)：每(mei)mg 組織蛋(dan)白每(mei)分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯(lv)酚靛酚定(ding)義(yi)為一個酶活性單(dan)位(wei)。

PDH活性（U /mg prot）=[(ΔA測定-ΔA空白)×V 反總÷(ε×d)×10⁹]÷(V樣×Cpr)÷T

=904.762×(ΔA測定-ΔA空白)÷Cpr

    （2） 按樣本鮮重(zhong)計算

     單(dan)位的定義：每g組織每分鐘消耗 1 nmol 2,6-二(er)氯酚靛酚定義為(wei)一個酶活性單(dan)位。

PDH活性(U/g鮮重)=[(ΔA測定-ΔA空白)×V反總÷(ε×d)×10⁹]÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=913.81×(ΔA測定-ΔA空白(bai))÷W

（3） 按細(xi)菌(jun)或細(xi)胞(bao)密(mi)度(du)計算

     單位的定義：每(mei)1萬個細菌或細胞每(mei)分(fen)鐘(zhong)消耗1 nmol 2,6-二(er)氯酚靛(dian)酚定義為一(yi)個酶活性單位。

     PDH 活性(U/10⁴ cell)=[(ΔA測定-ΔA空白)×V 反總÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=1.828×(ΔA測定-ΔA空白)

     V 反總：反應體系總體積，9.5×10^-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數，2.1×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.05 mL；V 樣總：加入試劑一和試劑二體積，1.01 mL；T：反應時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500 萬。

注意事項：

1、測定(ding)過(guo)程中所有(you)樣本在冰上放置，以免變性和失(shi)活。

2、測定(ding)管的ΔA值在0.01-0.25之間，若測定(ding)管的ΔA值大于0.25，需將樣本進(jin)行(xing)稀釋。 

 相關文獻：

《Engineering Corynebacterium glutamicum for high-titer biosynthesis of hyaluronic acid.》 作者:Fangyu Cheng,Huimin Yu,Gregory Stephanopoulos 期刊:Metab. Eng. 影響因子:7.808 PMID:31301358
 

丙酮酸脫氫酶(PDH)活性檢測試劑盒