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氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量檢測試劑盒?說明書

  可見分光光度法 BC1180 ：50T/48S 試劑一：液體1瓶，50ml，4℃保存。 試劑二：液體1支，170μl，4℃保存。 試劑三：液體1瓶 60ml，4℃保存。
試劑四：液體1瓶 8ml，4℃保存。 試劑五：粉劑1支，4℃保存，用前8ml蒸餾水溶解。 試劑六：液體1支，40μl，用前0.8ml蒸餾水稀釋。 標準品：粉劑1支，10mg，4℃避光保存。 氧化型谷胱甘肽（GSSG）是谷胱甘肽（GSH）的氧化形式，又稱為二硫代谷胱甘肽，是兩分子的谷胱甘肽氧化而成。GSSG會被谷胱甘肽還原酶還原成GSH，因此機體中大多數是以還原型形式存在。測定細胞內GSH和GSSG含量以及GSH/GSSG比值，能夠很好地反映細胞所處的氧化還原狀態。本試劑盒利用谷胱甘肽能和5，5’-二硫代-雙-（2-硝基苯甲酸）（5，5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）反應產生2-硝基-5-巰基苯甲酸，2-硝基-5-巰基苯甲酸在波長412nm處具有光吸收的特點，通過2-乙烯吡啶抑制樣品中原有的還原型谷胱甘肽，然后利用谷胱甘肽還原酶將GSSG還原為GSH，借此測定氧化型谷胱甘肽的含量。 分析天平、微量勻漿器（規格2ml）、低溫離心機、水浴鍋、移液器、可見分光光度計、1ml比色皿。
一、 樣品的處理
（1）組織處理 新鮮組織先用PBS沖洗2次，然后稱取動物組織或者植物組織0.1g。加入用試劑一潤洗過的勻漿器中（勻漿器提前放冰上預冷）；然后加入1ml試劑一（組織/試劑一比例保持不變即可），迅速冰上充分研磨（使用液氮研磨效果更好）；10000rpm 4℃離心10min；取上清液放置于4℃待測，若暫時不能完成測試可放于-80℃保存（可保存10天）。 （2）血液處理 血漿：將收集的抗凝血于4℃，600g離心10分鐘，吸取上層血漿到另一支試管中，加入等體積的試劑一，4℃，8000g離心10分鐘，將上清移入新的試管中放置于4℃待測，若暫時不能完成測試可放于-80℃保存（可保存10天）。
血細(xi)(xi)胞(bao)(bao)：將收(shou)集的(de)抗凝(ning)血于(yu)4℃，600g離(li)(li)心(xin)(xin)10分(fen)(fen)(fen)鐘，棄去上(shang)層血漿(jiang)用3倍體積的(de)PBS清(qing)洗(xi)3次(ci)（用PBS重(zhong)懸(xuan)(xuan)血細(xi)(xi)胞(bao)(bao)，600g離(li)(li)心(xin)(xin)10分(fen)(fen)(fen)鐘），加入等體積試(shi)劑一，混勻(yun)后4℃放(fang)(fang)置10分(fen)(fen)(fen)鐘，8000g離(li)(li)心(xin)(xin)10分(fen)(fen)(fen)鐘，吸取上(shang)清(qing)放(fang)(fang)于(yu)4℃待測(ce)，若暫時不能(neng)完成(cheng)測(ce)試(shi)可(ke)放(fang)(fang)于(yu)-80℃保(bao)(bao)存（可(ke)保(bao)(bao)存10天）。 （3）細(xi)(xi)胞(bao)(bao)處(chu)理 收(shou)集不少于(yu)108個細(xi)(xi)胞(bao)(bao)，先用PBS清(qing)洗(xi)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)2次(ci)（PBS重(zhong)懸(xuan)(xuan)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)，600g離(li)(li)心(xin)(xin)10分(fen)(fen)(fen)鐘），加入3倍細(xi)(xi)胞(bao)(bao)沉淀(dian)體積的(de)試(shi)劑一重(zhong)懸(xuan)(xuan)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)，反復(fu)凍融2-3次(ci)（可(ke)在液氮(dan)中(zhong)凍結，37℃水浴中(zhong)溶解），8000g離(li)(li)心(xin)(xin)10分(fen)(fen)(fen)鐘，收(shou)集上(shang)清(qing)于(yu)4℃待測(ce)，若暫時不能(neng)完成(cheng)測(ce)試(shi)可(ke)放(fang)(fang)于(yu)-80℃保(bao)(bao)存（可(ke)保(bao)(bao)存10天）。

二、氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量檢測試劑盒實驗操作：
1、分光光度計預熱30min以上，調節波長412nm，蒸餾水調零。
2、試劑二放置37℃（哺乳動物）或25℃（一般物種）水浴中保溫30min。
3、標準品的稀釋：將標準品用1ml蒸餾水溶解(4℃保存)，濃度為10mg/ml。取適當溶液配制濃度為25μg/ml、20μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml、0μg/ml的標準品（試劑一十倍稀釋后進行稀釋）。
4、取1.5ml離心管，加入100μL稀釋好的標準品或樣品，加入2μL試劑二，混勻后37℃孵育30分鐘。
5、制作標準曲線
孵育完成后標準管依次加入700μL試劑三，100 μL試劑四，100 μL試劑五，10 μL試劑六，迅速混勻后，測定412nm處30 s和150 s光吸收A1和A2。吸光度（A2-A1）為橫坐標（x），濃度為縱坐標（y）做標準曲線。
6、樣品管依次加入700μL試劑三，100 μL試劑四，100 μL試劑五，10 μL試劑六，迅速混勻后，測定412nm處30 s和150 s光吸收A1和A2，△A= A2- A1。
三、氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量檢測試劑盒GSSG含量計算 根據標準曲線，將樣品△A帶入公式中（x），計算出樣品濃度y（μg/ml）。 （1）按蛋白濃度計算 GSSG（μg / mg prot）=y×V 反總÷V 樣÷Cpr =y×10.12÷Cpr （2）按樣本質量計算 GSSG（μg /g）= y×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W)= y×10.12 ÷W （3）按細胞數量計算 GSSG（μg /104 cell）= y×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×細胞數量)= y×10.12 ÷細胞數量 （4）按液體體積計算 GSSG（μg / mL）= y×V 反總÷V 樣= y×10 V 反總：反應總體積，1.012mL；V 樣總：上清液總體積，1 mL；V 樣：加入反應體系中上清液體積，100μL=0.1 mL；W：樣品質量，g ；Cpr：上清液蛋白質濃度，mg/mL。
1、樣品處理需勻漿*，若當天不能完成測量，可放-80℃保存。
2、若不確定樣品中GSSG含量的高低，可稀釋幾個梯度后再進行測量。
3、此方法利用酶促反應速率計算底物濃度，盡量準確在30秒和150秒處完成讀數。
4、因為(wei)試劑一中(zhong)含有(you)蛋(dan)白質(zhi)沉淀劑，因此上(shang)清液(ye)不能用(yong)于(yu)蛋(dan)白濃度測(ce)定。