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凋亡檢測試劑盒AnnexinV Alexa Fluor488/PI

產(chan)品簡介：
細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)凋亡(wang)早(zao)(zao)期改(gai)變(bian)發生(sheng)(sheng)在(zai)(zai)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)膜(mo)表(biao)(biao)(biao)面，這些(xie)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)膜(mo)表(biao)(biao)(biao)面的(de)(de)(de)改(gai)變(bian)之一是(shi)磷脂(zhi)酰絲氨酸(suan)(PS)從細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)膜(mo)內轉移(yi)到細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)膜(mo)外，使 PS 暴(bao)露(lu)在(zai)(zai)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)膜(mo)外表(biao)(biao)(biao)面。PS 是(shi)一種帶負電荷的(de)(de)(de)磷脂(zhi)，正常主(zhu)要(yao)存在(zai)(zai)于(yu)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)膜(mo)的(de)(de)(de)內面，在(zai)(zai)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)發生(sheng)(sheng)凋亡(wang)時(shi)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)膜(mo)上的(de)(de)(de)這種磷脂(zhi)分布的(de)(de)(de)不(bu)對(dui)稱性被破(po)壞(huai)(huai)而使 PS 暴(bao)露(lu)在(zai)(zai)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)膜(mo)外。Annexin V 具有(you)易于(yu)結合到磷脂(zhi)類如 PS 的(de)(de)(de)特性，對(dui) PS 有(you)高(gao)度的(de)(de)(de)親和性。因此(ci)，該(gai)蛋白(bai)可充當一敏感(gan)的(de)(de)(de)探針檢測暴(bao)露(lu)在(zai)(zai)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)膜(mo)表(biao)(biao)(biao)面的(de)(de)(de) PS。PS 轉移(yi)到細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)膜(mo)外不(bu)是(shi)凋亡(wang)所*的(de)(de)(de)，也(ye)可發生(sheng)(sheng)在(zai)(zai)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)壞(huai)(huai)死(si)(si)中。兩種細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)死(si)(si)亡(wang)方式間的(de)(de)(de)差別是(shi)在(zai)(zai)凋亡(wang)的(de)(de)(de)初始階(jie)段細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)膜(mo)是(shi) 完(wan)好的(de)(de)(de)，而細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)壞(huai)(huai)死(si)(si)在(zai)(zai)其早(zao)(zao)期階(jie)段細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)膜(mo)的(de)(de)(de)完(wan)整性就(jiu)破(po)壞(huai)(huai)了。因此(ci)，可以采(cai)用Annexin V與PI 雙染的(de)(de)(de)方法，通過流式檢測細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)早(zao)(zao)期凋亡(wang)。

操作步驟:
1、細胞樣(yang)品的準備：
a)對于(yu)貼壁(bi)細(xi)(xi)胞(bao)：小心收集細(xi)(xi)胞(bao)培養液到一(yi)離心管內備(bei)用(yong)。用(yong)不含(han) EDTA 的胰酶消化(hua)細(xi)(xi)胞(bao)，細(xi)(xi)胞(bao)可以被輕(qing)輕(qing)
用移液管或槍頭(tou)吹(chui)(chui)打下(xia)來時，加入前面(mian)收(shou)集(ji)的細胞培養液，吹(chui)(chui)打下(xia)所有的貼壁細胞，并輕(qing)輕(qing)吹(chui)(chui)散細胞。再(zai)次
收集到離(li)心(xin)管內。1000rpm 左(zuo)右離(li)心(xin) 5min，沉(chen)淀(dian)細(xi)胞。對于特定的細(xi)胞，如(ru)果細(xi)胞無法*離(li)心(xin)離(li)心(xin)管底，
可以(yi)適(shi)當(dang)延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸(xi)除上清，可以(yi)殘留約 50µl 左(zuo)右的(de)培(pei)養(yang)液，以(yi)避免吸(xi)走細胞(bao)。
加入約(yue) 1ml 4℃預冷的 PBS，重懸細(xi)(xi)胞，再次離(li)心(xin)沉淀細(xi)(xi)胞，小(xiao)心(xin)吸除上清；
b)對于懸浮細(xi)胞(bao)(bao)：1000rpm 左右離(li)心(xin) 5min，沉淀細(xi)胞(bao)(bao)。對于特定(ding)的細(xi)胞(bao)(bao)，如果細(xi)胞(bao)(bao)無(wu)法*離(li)心(xin)離(li)心(xin)
管底，可以適(shi)當延(yan)長(chang)離心(xin)時(shi)間或稍(shao)稍(shao)加大離心(xin)力。小心(xin)吸(xi)除上清，可以殘留約 50µl 左右的培養液，以避免(mian)
吸走(zou)細(xi)胞(bao)。加(jia)入約(yue) 1ml 4℃ 預冷的 PBS，重(zhong)懸細(xi)胞(bao)，再次離心(xin)沉淀細(xi)胞(bao)，小心(xin)吸除上清；
2、用(yong)去(qu)離子水按(an) 1:3 稀釋結(jie)(jie)合緩(huan)沖液(4ml 4x 結(jie)(jie)合緩(huan)沖液+12ml 去(qu)離子水)；
3、用 1x 結合緩(huan)沖液重新懸(xuan)浮細胞，調節其濃度為 1-5×106/ml；
4、取(qu) 100µl 的細(xi)胞懸液于(yu) 5ml 流式管中，加入(ru) 5µl Annexin V/Alexa Fluor 488 混勻后于(yu)室溫避(bi)光孵育 5 分鐘(zhong)；
5、加(jia)入(ru) 10µl 20ug/ml 的(de)碘化(hua)丙錠溶液(PI)，并加(jia) 400µl PBS，立刻進行(xing)流式檢測。
實驗設計：
1、空白管：陰性(xing)對照組細胞(bao)，不加(jia) Annexin V/Alexa Fluor 488，碘化丙錠(ding)溶液(PI)。用于(yu)調節電壓；
2、單染管：陽性對(dui)照組(zu)細胞(bao)，只加(jia) Annexin V/Alexa Fluor 488。用于調節補(bu)償；
3、檢測管：處理(li)的(de)細胞(bao)，加 Annexin V/Alexa Fluor 488，碘化丙錠溶液(PI)。用空白(bai)管和單(dan)染(ran)管調(diao)節(jie)好(hao)電(dian)壓補償
后，獲(huo)得(de)所需要的(de)流式數據。
注意事項：
1、Annexin V 是(shi)與磷脂酰絲氨酸(PS)親和，而 PS 在(zai)不(bu)同種屬間沒差異。在(zai)正(zheng)常細(xi)胞(bao)(bao)中，PS 只(zhi)分布(bu)在(zai)細(xi)胞(bao)(bao)膜脂
質雙層的(de)內(nei)側，而在(zai)細(xi)胞凋亡早期，PS 由脂膜內(nei)側翻向外側；
2、低濃度胰酶消化，輕(qing)柔吹打貼壁(bi)細胞 2～3 次(ci)，離心(xin)機 4℃1000rpm 5min 離心(xin)，處理得當的(de)話，胰酶造成損
傷(shang)可以控制在 5%以內，有對照組的情況(kuang)下對實驗結果(guo)不會造成明顯影響。
3、先加(jia)PI 不僅染色是否每(mei)組都均勻充分很難判(pan)斷(duan)，而且 PI 本身對細胞(bao)也是有毒(du)性的，對實驗結果影響(xiang)會比胰
酶(mei)大，不(bu)建議這(zhe)樣做；
4、Annexin V 是Ca 依賴的蛋白，所(suo)以不能(neng)加入 EDTA，防止 EDTA 螯(ao)合(he)了 Ca 離子從而影響 Annexin V，進而影
響結果(guo)。
5、用流式檢(jian)測凋亡時(shi)(shi)，PI 受時(shi)(shi)間的(de)影(ying)響(xiang)很大，因(yin)標記了 PI 后會加大細胞毒(du)性(xing)，隨著(zhu)時(shi)(shi)間延長會導致 PI 的(de)染(ran)
色增加，特別是檢測早期凋亡(wang)時，如果時間延長除了(le)會導致(zhi)在流式細(xi)胞儀上的細(xi)胞分群差(cha)距(ju)加大(da)外，誤(wu)差(cha)會明顯
加大。一般 PI 加上后立刻(ke)上機，然后在(zai)一個小時內(nei)檢測(ce)完成。兩種方(fang)法都可以(yi)，但(dan)是按(an)照我(wo)們(men)操(cao)作步驟造成
的誤(wu)差會更小。

相關文獻：

《The establishment of clonally derived chicken embryonic fibroblast cell line (CSC) with high transfection efficiency and ability as a feeder cell》 作者:Ruifeng Zhao , Jing Jin , Xinyu Sun , Kai Jin , Man Wang , Mahmoud F. Ahmed , Qisheng Zuo , Yani Zhang ,Zhenhua Zhao , Guohong Chen , Bichun Li 期刊:Journal of cellular Biochemistry 影響因子:3.062 PMID:30076744
《Leukemia inhibitory factor promotes extracellular matrix synthesis in degenerative nucleus pulposus cells via MAPK-ERK1/2 signaling pathway》 作者:Hao Zhou,Jieliang Shen,Zhenming Hua,Xiaoming Zhong 期刊:Biochemical and Biophysical Research Communications 影響因子:2.705 PMID:30446227
 

凋亡檢測試劑盒AnnexinV Alexa Fluor488/PI