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鎳-瓊脂糖凝膠6FF（Ni-NTA Resin）

Ni-NTA瓊脂糖凝膠6FF是(shi)用(yong)于純(chun)(chun)化6×His標(biao)(biao)簽(qian)(qian)重(zhong)(zhong)組蛋白的(de)(de)(de)一(yi)種純(chun)(chun)化介質，它(ta)是(shi)由6%交聯的(de)(de)(de)Sepharose耦連了一(yi)種四齒(chi)螯(ao)合(he)(he)劑NTA而(er)得(de). 它(ta)可(ke)用(yong)于在非變(bian)性或(huo)變(bian)性條件下(xia)(xia)純(chun)(chun)化任何表(biao)達系統表(biao)達的(de)(de)(de)6×His標(biao)(biao)簽(qian)(qian)重(zhong)(zhong)組蛋白。NTA，含有四個螯(ao)合(he)(he)區，較(jiao)一(yi)般的(de)(de)(de)三齒(chi)螯(ao)合(he)(he)劑能更好的(de)(de)(de)結(jie)合(he)(he)Ni2+。6×His可(ke)與Ni2+螯(ao)合(he)(he)，從(cong)而(er)使His標(biao)(biao)簽(qian)(qian)蛋白結(jie)合(he)(he)在Ni-NTA純(chun)(chun)化介質上，未結(jie)合(he)(he)的(de)(de)(de)蛋白被洗滌下(xia)(xia)去，結(jie)合(he)(he)在介質上的(de)(de)(de)蛋白經(jing)過一(yi)定濃度(du)(du)的(de)(de)(de)咪唑(zuo)或(huo)低pH緩(huan)沖液的(de)(de)(de)溫和洗脫下(xia)(xia)來，從(cong)而(er)得(de)到高純(chun)(chun)度(du)(du)的(de)(de)(de)目的(de)(de)(de)蛋白。該(gai)純(chun)(chun)化介質與His標(biao)(biao)簽(qian)(qian)蛋白具有*的(de)(de)(de)親和力，可(ke)達5-20 mg/ml。可(ke)在非變(bian)性和變(bian)性條件下(xia)(xia)純(chun)(chun)化任何表(biao)達系統所得(de)的(de)(de)(de)His標(biao)(biao)簽(qian)(qian)蛋白。純(chun)(chun)化程序簡單(dan)，所得(de)的(de)(de)(de)蛋白純(chun)(chun)度(du)(du)可(ke)高達95％。Ni-NTA可(ke)再生4-6次，重(zhong)(zhong)復使用(yong)。本(ben)產(chan)品懸浮液為20％乙(yi)醇，已螯(ao)合(he)(he)Ni2+。

操作方法：

A. 非變性條件下抽提His標簽蛋白

1) 準備細(xi)(xi)胞，接種(zhong)，誘(you)導表(biao)達。收集細(xi)(xi)胞，置于-70°C或(huo)立即進行步驟2操作。

2) 加(jia)入1/20細胞生長體積的NTA-0 Buffer和PMSF。PMSF使(shi)用的工作濃度為1 mM現用現加(jia)。

3) 將細胞懸浮起(qi)來(lai)，加入溶(rong)菌酶，混勻，冰上放置30分鐘，超(chao)聲或勻漿破碎細胞。該步驟(zou)冰上操作(zuo)。

4) 加入10% Triton X-100, 使終(zhong)濃(nong)度為0.05%，充分混勻，冰上放置15分鐘。

5) 12000 rpm/min(20,000×g以上(shang))，4°C離(li)心15分(fen)鐘(zhong)以上(shang)。取上(shang)清(qing)，置于冰上(shang)備用或-20°C保存。

6) 將NTA樹(shu)脂裝入合(he)適的(de)層析(xi)柱，層析(xi)用10倍NTA體(ti)積的(de)NTA-0 Buffer洗。

7) 將樣品加NTA層析柱中，流速在15 ml/h左(zuo)右，收集穿透部分(fen)，用SDS/PAGE分(fen)析蛋白(bai)的結合情(qing)況(kuang)。

8) 層析(xi)用5倍NTA體(ti)積的NTA-0 Buffer洗(xi)，流速控(kong)制在(zai)30 ml/h左右。

9) 分(fen)別用5倍(bei)NTA體積的NTA-20、NTA-40、NTA-60、NTA-80、NTA-100、NTA-200、NTA-1000 Buffer洗(xi)脫，流速控制在15 ml/h左右，收集洗(xi)脫液(ye)，每管(guan)收集一個NTA體積。

10) 確定目(mu)標蛋白(bai)質在洗脫液中的分布(bu)情況。為(wei)有效的方式是(shi)SDS-PAGE分析(xi)。也可以(yi)用(yong)Bradford 蛋白(bai)質測定試劑(ji)盒，快速(su)確定蛋白(bai)質的含量，然后用(yong)SDS/PAGE分析(xi)蛋白(bai)質的分布(bu)。

11)純化的(de)目標蛋白質(zhi)的(de)保存條(tiao)件需要(yao)根據蛋白質(zhi)的(de)性質(zhi)和用途確(que)定。 NTA-0 、20、40、60、80、100、200、1000Buffer分別為濃(nong)度20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl, 10% Glycerol，添加(jia)0、20、40、60、80、100、200、1000 mM Imidazole。

B.變性條件下從包涵體中純化His標簽蛋白

1) 準備細(xi)(xi)胞，接種，誘(you)導(dao)表達(da)。收集(ji)細(xi)(xi)胞，置于-70°C或立(li)即進行步驟2操作。

2) 加(jia)入1/20細胞(bao)生長體(ti)積的GuNTA-0 Buffer和(he)PMSF。PMSF使(shi)用的工作濃(nong)度為(wei)1 mM現用現加(jia)。

3) 將細(xi)(xi)胞(bao)懸浮起來，冰上超聲破碎細(xi)(xi)胞(bao)，降低粘稠度(du)。

4) 室溫(wen)放置30分鐘(zhong)，間(jian)或混勻或用磁力攪拌(ban)。

5) 12000轉/分(fen)（20,000×g以(yi)上），4°C離心(xin)15分(fen)鐘(zhong)以(yi)上。取(qu)上清，置(zhi)于冰上備用或(huo)-20°C保存(cun)。

6) 將NTA樹(shu)脂裝(zhuang)入合適的(de)層析柱，層析用10倍NTA體積的(de)GuNTA-0 Buffer洗。

7) 將樣品加到NTA層析(xi)柱中，流速控制(zhi)在15 ml/h左右，收集穿透部(bu)分(fen)，用于(yu)SDS/PAGE分(fen)析(xi)蛋白(bai)質(zhi)的結合情(qing)況。

8) 層析用5倍NTA體(ti)積的GuNTA-0 Buffer洗(xi)，流速控制在30 ml/h左右。

9) 分別用5倍NTA體(ti)積(ji)GuNTA-20、GuNTA-40，GuNTA-60、GuNTA-100、GuNTA-500洗脫(tuo)，流速在15 ml/ h左右，收(shou)集洗脫(tuo)液(ye)，每管(guan)收(shou)集一(yi)個NTA體(ti)積(ji)。

10) 確定目標蛋白(bai)質(zhi)在洗(xi)脫液中的分(fen)布情況。為有效(xiao)的方式是(shi)SDS/PAGE分(fen)析(xi)。也可以用(yong)Bradford 蛋白(bai)質(zhi)測定試劑盒(he)，快速確定蛋白(bai)質(zhi)的含(han)量，然后用(yong)SDS/PAGE分(fen)析(xi)蛋白(bai)質(zhi)的分(fen)布。

11) 目標蛋白(bai)質需要進一步純化需要根據蛋白(bai)質的用途確定。

12) 純(chun)化的(de)目標蛋白質需(xu)要復性，復性常用的(de)手段可以(yi)參考有關手冊確定的(de)原則。

GuNTA-0 、20、40、60、100、500Buffer分別為濃度(du)20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl, 10% Glycerol,6 M Guanidium HCl添加(jia)0、20、40、60、100、500 mM Imidazole。

C. NTA樹脂的再生

NTA樹脂在(zai)使(shi)用(yong)(yong)若干(gan)次(ci)數（3-5次(ci)）后，結(jie)合(he)效率(lv)有所下降，可以用(yong)(yong)以下方(fang)法再(zai)生，提高樹脂的(de)使(shi)用(yong)(yong)壽命和蛋白質的(de)結(jie)合(he)效率(lv)。

NTA樹脂再生(sheng)(sheng)前需要從層析柱(zhu)(zhu)下端流干所有(you)溶液，估計(ji)出NTA的樹脂體積，按下列次序將再生(sheng)(sheng)試劑加到(dao)層析柱(zhu)(zhu)里，在等上一步(bu)再生(sheng)(sheng)溶液流干后(hou)，再加下一步(bu)再生(sheng)(sheng)溶解。

用戶需要自(zi)行準備25%、50%、75%、100%（v/v）乙醇(chun)(chun)(chun)(chun)(chun)和去(qu)離子水(shui)(shui)。 從層析柱(zhu)下端流干所有溶液，用2倍(bei)NTA樹脂(zhi)體(ti)積(ji)(ji)(ji)的(de)(de)Stripping Solution I、2倍(bei)體(ti)積(ji)(ji)(ji)的(de)(de)去(qu)離子水(shui)(shui)、3倍(bei)體(ti)積(ji)(ji)(ji)的(de)(de)Stripping Solution II、1倍(bei)體(ti)積(ji)(ji)(ji)的(de)(de)25%乙醇(chun)(chun)(chun)(chun)(chun)、1倍(bei)體(ti)積(ji)(ji)(ji)的(de)(de)50%乙醇(chun)(chun)(chun)(chun)(chun)、1倍(bei)體(ti)積(ji)(ji)(ji)的(de)(de)75%乙醇(chun)(chun)(chun)(chun)(chun)、5倍(bei)體(ti)積(ji)(ji)(ji)的(de)(de)100%乙醇(chun)(chun)(chun)(chun)(chun)、1倍(bei)體(ti)積(ji)(ji)(ji)的(de)(de)75%乙醇(chun)(chun)(chun)(chun)(chun)、1倍(bei)體(ti)積(ji)(ji)(ji)的(de)(de)50%乙醇(chun)(chun)(chun)(chun)(chun)、1倍(bei)體(ti)積(ji)(ji)(ji)的(de)(de)25%乙醇(chun)(chun)(chun)(chun)(chun)、1倍(bei)體(ti)積(ji)(ji)(ji)的(de)(de)去(qu)離子水(shui)(shui)、5倍(bei)體(ti)積(ji)(ji)(ji)的(de)(de)Stripping Solution III、3倍(bei)體(ti)積(ji)(ji)(ji)的(de)(de)去(qu)離子水(shui)(shui)分別洗一遍。

如果立即使(shi)用(yong)(yong)(yong)，用(yong)(yong)(yong)5倍體(ti)積的(de)Ni Charging Solution洗(xi)，再用(yong)(yong)(yong)10倍體(ti)積的(de)平衡溶液（NTA-0Buffer或(huo)(huo)GuNTA-0 Buffer）洗(xi)；如果想長期儲存，加(jia)入1倍體(ti)積的(de)20%乙醇，4°C保存，使(shi)用(yong)(yong)(yong)前用(yong)(yong)(yong)5倍體(ti)積的(de)Ni Charging Solution洗(xi)，再用(yong)(yong)(yong)10倍體(ti)積的(de)平衡溶液（NTA-0Buffer或(huo)(huo)GuNTA-0 Buffer）洗(xi)

再生(sheng)溶液配方(fang)：Stripping Solution I:  6M GuHCl, 0.2M acetic acid。Stripping Solution II: 2% SDS。        Stripping Solution III: 100 mM EDTA, pH 8.0。Ni Charging Solution: 100 mM NiSO4

鎳-瓊脂糖凝膠6FF（Ni-NTA Resin）