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丙酮酸(suan)脫氫酶(mei)（PDH）活性檢測試(shi)劑盒 微量法(fa)

貨號：BC0385

規格：100T/96S

產品內容：

試劑一：110mL×1瓶(ping)，4℃保存(cun)；

試(shi)劑二：1mL×1支，-20℃避光保存(cun)；

試(shi)劑(ji)三：液(ye)體20mL×1瓶，4℃保存；

試(shi)劑(ji)四：粉劑(ji)×1支(zhi)，4℃保存；

試(shi)劑(ji)五：粉劑(ji)×1支，-20℃保(bao)存；

試劑六：粉劑×1支，4℃保存；臨用前加(jia)入1mL蒸(zheng)餾水；

試劑七：粉劑×1支，4℃保(bao)存；

工作液的配制：臨用前把試劑四、五、0.5mL六、七轉移到試劑三中混合溶解待用。

產品說明：

     PDH（EC 4.1.1.1）廣泛(fan)存在(zai)于動物(wu)(wu)、植物(wu)(wu)、微生物(wu)(wu)和培養細胞中，是(shi)丙(bing)酮酸脫(tuo)氫酶(mei)復合體(PDHC)催化丙(bing)酮酸氧化脫(tuo)羧的(de)限(xian)速酶(mei)，催化丙(bing)酮酸脫(tuo)梭(suo)生成羥乙基-TPP，把糖酵(jiao)解和三羧酸循環連接起(qi)來。

    PDH催化丙酮酸脫氫(qing)，同時還原2,6-二氯酚靛酚（2,6-DCPIP），從(cong)而導致(zhi)605nm光吸(xi)收的減(jian)少(shao)。

需自備的儀器和(he)用品

    可(ke)(ke)見分光光度計/酶標儀、水(shui)浴鍋、臺式(shi)離(li)心機、可(ke)(ke)調式(shi)移液器(qi)、微量(liang)比色皿(min)/96孔板、研缽、冰(bing)和蒸餾水(shui)。

操作步驟：

一、PDH的提取

    準確稱取(qu)0.1g組織或(huo)收集500萬細胞，加入1mL試(shi)劑一和10uL 試(shi)劑二，用冰浴(yu)勻漿器(qi)或(huo)研(yan)缽勻漿充分研(yan)磨，4 ℃ 11000 g離心10min，取(qu)上(shang)清，置冰上(shang)待(dai)測。

二、測定步驟

• 分光(guang)光(guang)度計或酶標儀預熱30min以上，調節波(bo)長(chang)605nm，蒸餾水調零。
• 每(mei)個樣本(ben)(ben)需(xu)要180μL工(gong)作液(ye)，按樣本(ben)(ben)數取出(chu)一定量的工(gong)作液(ye)置于37℃（哺乳動物）或25℃（其(qi)它物種）水浴10min。
• 空白管：在微量比色皿或96孔板中加入180μL工作液和10μL水，混勻，立即記錄605nm處初始吸光值A1和 1min后的吸光值A2，計算ΔA_空白=A1-A2。
• 測定管：在微量比色皿或96孔板中加入180μL工作液和10μL樣本，混勻，立即記錄605nm處初始吸光值A3和 1min后的吸光值A4，計算ΔA_測定=A3-A4。
•  

三、PDH活(huo)性計算

a.用微量比色皿測(ce)定(ding)的(de)計算(suan)公式(shi)如(ru)下(xia)

（1） 按樣本蛋白(bai)濃度計(ji)算

單位的(de)定義：每mg組織蛋白在反應體系中(zhong)每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶(mei)活性(xing)單位。

PDH活性（U/mg prot）＝[(ΔA測定-ΔA空白)÷（ε×d）×V反總×10⁹]÷(Cpr×V樣) ÷T

=904.762×(ΔA測(ce)定(ding)-ΔA空白)÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算(suan)

單(dan)位(wei)的定(ding)義：每g組織在反應體系中每分鐘(zhong)消耗1 nmol 2,6-二氯(lv)酚靛酚定(ding)義為一個酶活性單(dan)位(wei)。

PDH活性（U/g 鮮重）＝[(ΔA測定-ΔA空白)÷（ε×d）×V反總×10⁹]÷(V樣÷V樣總×W) ÷T=913.81×(ΔA測定(ding)-ΔA空白(bai))÷W

（3） 按細(xi)菌(jun)或細(xi)胞密度計算

單位(wei)的(de)定(ding)(ding)義：每1萬個細菌或細胞在反應體(ti)系中(zhong)每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚(fen)靛酚(fen)定(ding)(ding)義為一個酶活性單位(wei)。

PDH活性（U/10⁴ cell）＝[(ΔA測定-ΔA空白)×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣÷V樣總×500)÷T=1.828×(ΔA測定(ding)-ΔA空白)

V反總：反應體系總體積，1.9×10^-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數，2.1×10⁴L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入試劑一和試劑二體積，1.01 mL；T：反應時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣品質量，g；500：細菌或細胞總數，500萬。

b.用96孔板測定的計算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度(du)計算

單位的定(ding)義：每mg組(zu)織蛋白在(zai)反應體系(xi)中每分鐘(zhong)消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定(ding)義為一(yi)個酶活性單位。

PDH活性（U/mg prot）＝[(ΔA測定-ΔA空白)×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V樣) ÷T

=1809.524×(ΔA測定-ΔA空(kong)白)÷Cpr

（2） 按樣(yang)本鮮重計算

單(dan)位的定義(yi)(yi)：每(mei)g組織在(zai)反應體系中每(mei)分鐘(zhong)消耗1 nmol 2,6-二(er)氯酚靛酚定義(yi)(yi)為一(yi)個(ge)酶活(huo)性單(dan)位。

PDH活性（U/g 鮮重）＝[(ΔA測定-ΔA空白)×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣÷V樣總×W) ÷T=1827.62×(ΔA測(ce)定-ΔA空白(bai))÷W

（3） 按細(xi)菌(jun)或細(xi)胞密度計(ji)算

單(dan)位(wei)的定義(yi)：每(mei)1萬(wan)個細(xi)菌(jun)或(huo)細(xi)胞(bao)在反應體系(xi)中每(mei)分(fen)鐘消(xiao)耗1 nmol 2,6-二(er)氯(lv)酚(fen)靛酚(fen)定義(yi)為一個酶活性(xing)單(dan)位(wei)。

PDH活性（U/10⁴ cell）＝[(ΔA測定-ΔA空白)×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣÷V樣總×500) ÷T=3.655×(ΔA測(ce)定(ding)-ΔA空白)

V反總：反應體系總體積，1.9×10^-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數，21×10³mol/L/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入試劑一和試劑二體積，1.01 mL；T：反應時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣品質量，g；500：細菌或細胞總數，500萬。

注意事項：

1、測定過程(cheng)中所(suo)有(you)樣(yang)本在(zai)冰上(shang)放置，以免(mian)變(bian)性(xing)和(he)失活。

2、測(ce)定管的(de)ΔA值(zhi)在0.01-0.25之間，若測(ce)定管的(de)ΔA值(zhi)大(da)于(yu)0.25，需將樣本(ben)進行稀(xi)釋。

 相關文獻：

《Rare ginsenosides ameliorate lipid overload-induced myocardial insulin resistance via modulating metabolic flexibility.》 作者:Shuang Peng,Yilei Wang,Ying Zhou,Tingting Ma,Yapu Wang,Jia Li,Fang Huang,Junping Kou,Lianwen Qi,Baolin Liu,Kang Liu 期刊:Phytomedicine 影響因子:4.18 PMID:31005715
 

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