產品名稱：Omega-質粒提取(qu)試劑盒
產品型號：D6943
產品報價：
產品特點：Omega-質粒提取試劑盒產品簡介： 試劑盒采用酶法破碎酵母細胞壁和堿裂解法裂解酵母細胞來提取酵母質粒 DNA。所采用的酵母破壁酶能有效地破壞酵母細胞壁，提高酵母質粒 DNA 的產量。吸附柱中采用的硅基質材料能高效、專一地附 DNA，可限度去除雜質蛋白質及細胞中其他有機化合物。使用本試劑盒提取的酵母質粒DNA可適用于各種常規的分子生物學實驗，包括酶切、PCR、測序、連接和轉化等試驗
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Omega-質粒提取試劑盒
操作步驟：
使(shi)用前請先在(zai)漂洗液中加入(ru)(ru)無水乙醇，加入(ru)(ru)體積請參照(zhao)瓶上的標簽(qian)。溶液YP1在(zai)使(shi)用前先加入(ru)(ru)RNaseA（將(jiang)試劑盒(he)中提供的 RNaseA全部(bu)加入(ru)(ru)），混勻，置于 2-8℃保存。如(ru)非(fei)指(zhi)明，所有離心(xin)步驟均為(wei)使(shi)用臺式
離心機在室溫下離心。
1、取1-5ml酵母培養物(wu)（不超過 5×107cells），12000rpm離心(xin) 1min，盡量吸除上清（菌液較多時(shi)可以通過多次離心(xin)將菌體沉淀收集到一個離心(xin)管中）。
2、酵母細(xi)胞壁的破除：
A、酶法：向酵(jiao)母(mu)菌體中加入(ru) 470ul 山(shan)梨醇 Buffer，充分懸(xuan)浮菌體，加入(ru) 25ul 酵(jiao)母(mu)破壁酶和(he) 5ul β-巰基乙醇，充分混勻，30℃處理 1-2h，期間可顛倒離(li)心管混勻數(shu)次。12000rpm 離(li)心 1min，棄上清(qing)，收集沉淀(dian)(dian)。向沉淀(dian)(dian)中加入(ru) 250ul 溶(rong)液 YP1（請先檢查是否已加入(ru) RNaseA） ，充分懸(xuan)浮沉淀(dian)(dian)。注(zhu)意(yi)：如果菌塊未(wei)*混勻，會影響(xiang)裂解(jie)導致質粒提取量(liang)和(he)純度偏低。
B、玻(bo)璃(li)(li)珠(zhu)法(fa)：向酵(jiao)母菌體中加(jia)入(ru) 250ul 溶(rong)液 YP1（請先檢查是否已加(jia)入(ru) RNaseA） ，充分懸浮沉淀。加(jia)入(ru) 150-200ul酸洗(xi)玻(bo)璃(li)(li)珠(zhu)（自備），漩渦(wo)振蕩 10min。簡短離心使玻(bo)璃(li)(li)珠(zhu)沉降到離心管底(di)，吸取上清(qing)（如上清(qing)有(you)所(suo)損(sun)失，請用溶(rong)液 YP1 補足 250ul）于另一干凈離心管中。
3、向離心管(guan)中加入 250ul溶液 YP2，溫(wen)和(he)地(di)上下翻轉 6-8 次使菌(jun)體充(chong)分裂解。注意：混勻一定要溫(wen)和(he)，以(yi)
免污(wu)染細菌基因組 DNA，此時(shi)菌液應變得清亮粘稠，作(zuo)用(yong)時(shi)間不要超過(guo) 5 min，以免質粒受到破壞。
4、向離心管中加入 350ul溶液(ye) YP3，立即溫和地上下翻(fan)轉 6-8次，充分混(hun)勻，此時會出(chu)現白色絮(xu)狀沉淀。12000rpm離心 10 min，用(yong)移液(ye)器(qi)小心地將上清轉移到另一個干凈(jing)的離心管中，盡量不要吸(xi)出(chu)沉淀。注意(yi)：溶液(ye) YP3 加入后應(ying)立即混(hun)合，避免產(chan)生局(ju)部(bu)沉淀。如果上清中還(huan)有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。
5、將上一步所得上清(qing)液加入吸附柱中，室溫放置 2min，12000rpm 離(li)心 1min，倒掉收集(ji)管(guan)中的廢液，吸附柱重新(xin)放回收集(ji)管(guan)中。
6、向吸(xi)附柱(zhu)中加入(ru) 700ul 漂洗(xi)液(使用前請先檢查是否已加入(ru)無(wu)水乙醇)，12000rpm 離心 1min，棄(qi)廢(fei)液，將吸(xi)附柱(zhu)放入(ru)收集管中。
7、向吸附柱中(zhong)加入 500ul漂洗(xi)液，12000rpm離心 1min，棄廢(fei)液，將(jiang)吸附柱放入收集管中(zhong)。
8、12000rpm 離心 2min，將吸附柱敞口置于室溫或(huo) 50℃溫箱放置數分(fen)鐘，目的(de)是(shi)將吸附柱中(zhong)(zhong)殘余的(de)漂洗(xi)液去除，否(fou)則(ze)漂洗(xi)液中(zhong)(zhong)的(de)乙醇會影響后續的(de)實驗如酶(mei)切(qie)、PCR 等。
9、將吸(xi)附柱放入一個干凈(jing)的離(li)心管中，向吸(xi)附膜中央懸空滴加 50-200ul 經(jing) 65℃水浴(yu)預熱的洗脫液，室溫放置 2min，12000rpm離(li)心 1min。
10、為(wei)了(le)增加(jia)(jia)質粒的回收效率，可將得(de)到的洗脫液重新(xin)加(jia)(jia)入吸附柱(zhu)中，室溫放置(zhi) 2min， 12000rpm離(li)心 1min。
注意(yi)事項(xiang)：
1、使用前請先檢查溶液 YP2 和(he)溶液 YP3 是否出現(xian)(xian)混(hun)濁(zhuo)，如有混(hun)濁(zhuo)現(xian)(xian)象(xiang)，可在 37℃水浴中(zhong)加(jia)熱幾分(fen)鐘(zhong)，待溶液恢復澄清(qing)后再使用。
2、洗(xi)脫(tuo)(tuo)緩沖液(ye)體(ti)積(ji)不應少于(yu) 50ul，體(ti)積(ji)過小影響回收效率；洗(xi)脫(tuo)(tuo)液(ye)的 pH值(zhi)對洗(xi)脫(tuo)(tuo)效率也有(you)影響，若需要用水做(zuo)洗(xi)脫(tuo)(tuo)液(ye)應保證其 pH 值(zhi)在 8.0 左(zuo)右(可用 NaOH 將水的 pH 值(zhi)調(diao)此范(fan)圍)，pH 值(zhi)低(di)于(yu) 7.0 會降低(di)。洗(xi)脫(tuo)(tuo)效率；DNA產物應保存在-20℃，以防 DNA降解。
3、質粒得率(lv)與酵母菌(jun)株、質粒拷貝數(shu)、培養條(tiao)件等因素有關。通常(chang)酵母質粒拷貝數(shu)都很(hen)低，一般通過電(dian)泳或分光光度計法都很(hen)難檢測到，可通過 PCR或轉化大(da)腸桿菌(jun)來檢測。
4、DNA濃度(du)及純度(du)檢(jian)測(ce)：得到的基(ji)因(yin)組DN**段的大小與樣品保存時間(jian)、操作過程中(zhong)的剪切(qie)力等(deng)因(yin)素有關。回收得到的DN**段可用瓊脂糖(tang)凝膠電泳和紫外分(fen)光(guang)光(guang)度(du)計檢(jian)測(ce)濃度(du)與純度(du)。DNA應(ying)在(zai)OD260處有顯著吸收峰， OD260值為 1 相當于大約(yue) 50 μg/ml雙鏈(lian)DNA、40 μg/ml單鏈(lian)DNA。OD260/OD280比值應(ying)為1.7-1.9，如果洗(xi)脫時不(bu)使(shi)用洗(xi)脫緩沖液，而使(shi)用去離(li)子水，比值會(hui)偏低，因(yin)為pH值和離(li)子存在(zai)會(hui)影響(xiang)光(guang)吸收值，但并不(bu)表示純度(du)低。
Omega-質粒提取試劑盒
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