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solarbio-真菌基因組DNA提取試劑盒
 真菌是具有真核和細胞壁的異養生物。種屬很多，已報道的屬達1萬以上，種超過10萬個。真菌通常又分為三類，即酵母菌、霉菌和蕈菌（大型真菌）。對于酵母菌和霉菌，可以用玻璃珠處理，而對于大型真菌，可直接用液氮研磨。經過前期處理的菌液，用硅質膜吸附，即可得到高純度的基因組。提取純化后的DNA，可以直接用于 PCR/Real time-PCR，sequencing，Southern blot，mutant analysis，SNP 等下游應用實驗。
操作步驟： 使用前請先在漂洗液中加入無水乙醇，加入體積請參照瓶體上的標簽。所有離心步驟均為使用臺式離心機在室溫下離心。 1、樣品的處理： 1）對于酵母菌，取1-2ml培養好的菌液，離心收集，棄上清。加入200ul 溶液A，加入20ul RNase A，再加入100mg玻璃珠，在高速振蕩器上振蕩，約5-10min。 2）霉菌(孢子也可相同處理)：取50-100mg菌絲，加200ul溶液A，用玻璃研磨器適當研磨分散菌絲，加入20ul RNase A，再加入100mg玻璃珠，在高速振蕩器上振蕩，約30min。 3）大型真菌（如蘑菇等）：稱取50-100mg樣品，倒入適量的液氮，立即研磨重復3 次，使樣品研成粉末（如無液氮，可加200ul溶液A后用玻璃研磨器適當研磨），加200ul溶液A，加入20ul RNase A，再加入100mg玻璃珠，在高速振蕩器上振蕩，約5min。 2、加入20ul 10mg/ml的蛋白酶K，充分混勻，55℃水浴消化，30min。消化期間可顛倒離心管混勻數次，12000rpm離心2min。將上清轉移到一個新的離心管中。如有沉淀，可再次離心。 3、在上清中加入200ul溶液B，充分混勻。如出現白色沉淀，可放55℃水浴5min，沉淀即會消失，不影響后續實驗。如溶液未變清亮，說明樣品消化不*，可能導致提取的DNA量少及不純，還有可能導致上柱后堵
柱(zhu)(zhu)子，請增加消化時間。 4、再(zai)加入(ru)(ru)200ul無(wu)水乙(yi)醇，充分混(hun)勻，此時可能會(hui)出現(xian)絮(xu)(xu)狀沉淀(dian)，不影響DNA的(de)(de)提取，將(jiang)溶液(ye)和絮(xu)(xu)狀沉淀(dian)都加入(ru)(ru)吸(xi)附柱(zhu)(zhu)中(zhong)(zhong)，放(fang)置2分鐘。 5、12000rpm離(li)(li)心(xin)(xin)(xin)1min，棄(qi)(qi)(qi)廢(fei)液(ye)，將(jiang)吸(xi)附柱(zhu)(zhu)放(fang)入(ru)(ru)收集(ji)(ji)管(guan)中(zhong)(zhong)。 6、向吸(xi)附柱(zhu)(zhu)中(zhong)(zhong)加入(ru)(ru)700ul漂(piao)洗液(ye)(使用(yong)前請先檢查是否已加入(ru)(ru)無(wu)水乙(yi)醇)，12000rpm離(li)(li)心(xin)(xin)(xin)1min，棄(qi)(qi)(qi)廢(fei)液(ye)，將(jiang)吸(xi)附柱(zhu)(zhu)放(fang)入(ru)(ru)收集(ji)(ji)管(guan)中(zhong)(zhong)。 7、向吸(xi)附柱(zhu)(zhu)中(zhong)(zhong)加入(ru)(ru)500ul漂(piao)洗液(ye)，12000rpm離(li)(li)心(xin)(xin)(xin)1min，棄(qi)(qi)(qi)廢(fei)液(ye)，將(jiang)吸(xi)附柱(zhu)(zhu)放(fang)入(ru)(ru)收集(ji)(ji)管(guan)中(zhong)(zhong)。 8、12000rpm離(li)(li)心(xin)(xin)(xin)2min，將(jiang)吸(xi)附柱(zhu)(zhu)置于室溫(wen)或50℃溫(wen)箱(xiang)放(fang)置數(shu)分鐘，目(mu)的(de)(de)是將(jiang)吸(xi)附柱(zhu)(zhu)中(zhong)(zhong)殘余(yu)的(de)(de)漂(piao)洗液(ye)去除，否則漂(piao)洗液(ye)中(zhong)(zhong)的(de)(de)乙(yi)醇會(hui)影響后續(xu)的(de)(de)實驗如酶切、PCR等(deng)。 9、將(jiang)吸(xi)附柱(zhu)(zhu)放(fang)入(ru)(ru)一(yi)個(ge)干凈的(de)(de)離(li)(li)心(xin)(xin)(xin)管(guan)中(zhong)(zhong)，向吸(xi)附膜(mo)中(zhong)(zhong)央懸空滴加50-200ul經65℃水浴(yu)預熱(re)的(de)(de)洗脫液(ye)，室溫(wen)放(fang)置5min，12000rpm離(li)(li)心(xin)(xin)(xin)1min。 10、離(li)(li)心(xin)(xin)(xin)所得(de)洗脫液(ye)再(zai)加入(ru)(ru)吸(xi)附柱(zhu)(zhu)中(zhong)(zhong)，室溫(wen)放(fang)置2min，12000rpm離(li)(li)心(xin)(xin)(xin)2min，即(ji)可得(de)到高質量(liang)的(de)(de)基因組DNA。

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注意(yi)事項： 1. 由于(yu)真菌種類萬千，對于(yu)一(yi)些特別難處(chu)理的(de)(de)真菌，可(ke)(ke)(ke)用(yong)液(ye)(ye)(ye)(ye)氮研磨，再用(yong)玻(bo)璃珠(zhu)振蕩(dang)，蛋白(bai)酶K處(chu)理，一(yi)般都可(ke)(ke)(ke)以(yi)得(de)到(dao)(dao)(dao)一(yi)定量的(de)(de)基因(yin)組(zu)DNA，如電泳(yong)檢(jian)(jian)測很(hen)弱，一(yi)般PCR都會(hui)有(you)較好(hao)結果(guo)。 2. 若溶液(ye)(ye)(ye)(ye)A或溶液(ye)(ye)(ye)(ye)B中有(you)沉(chen)淀(dian)，可(ke)(ke)(ke)在(zai)55℃水(shui)(shui)浴中重新溶解。 3. 如果(guo)DNA提(ti)取量很(hen)少，可(ke)(ke)(ke)加(jia)長(chang)玻(bo)璃珠(zhu)處(chu)理時間，如果(guo)提(ti)取DNA成彌散(san)短(duan)條帶，可(ke)(ke)(ke)減少玻(bo)璃珠(zhu)處(chu)理時間。 4. 洗脫(tuo)緩(huan)沖液(ye)(ye)(ye)(ye)的(de)(de)體積好(hao)不(bu)少于(yu)50ul，體積過(guo)(guo)小會(hui)影(ying)響回收(shou)效率；洗脫(tuo)液(ye)(ye)(ye)(ye)的(de)(de)pH值(zhi)對洗脫(tuo)效率也有(you)影(ying)響，若需要用(yong)水(shui)(shui)做洗脫(tuo)液(ye)(ye)(ye)(ye)應(ying)保(bao)證其(qi)pH值(zhi)在(zai)8.0左右(可(ke)(ke)(ke)用(yong)NaOH將水(shui)(shui)的(de)(de)pH值(zhi)調(diao)此范圍(wei))，pH值(zhi)低于(yu)7.0會(hui)降(jiang)低洗脫(tuo)效率；DNA產物應(ying)保(bao)存(cun)在(zai)-20℃，以(yi)防DNA降(jiang)解。 5. DNA濃度及純度檢(jian)(jian)測：得(de)到(dao)(dao)(dao)的(de)(de)基因(yin)組(zu)DNA片(pian)段的(de)(de)大(da)小與樣品(pin)保(bao)存(cun)時間、操作(zuo)過(guo)(guo)程中的(de)(de)剪切力等因(yin)素有(you)關。回收(shou)得(de)到(dao)(dao)(dao)的(de)(de)DNA段可(ke)(ke)(ke)用(yong)瓊(qiong)脂(zhi)糖凝膠電泳(yong)和紫外分光光度計檢(jian)(jian)測濃度與純度。DNA應(ying)在(zai)OD260處(chu)有(you)顯(xian)著(zhu)吸(xi)收(shou)峰(feng)，OD260值(zhi)為(wei)1相當于(yu)大(da)約50 μg/ml雙鏈DNA、40 μg/ml單鏈DNA。OD260/OD280比(bi)值(zhi)應(ying)為(wei)1.7-1.9，如果(guo)洗脫(tuo)時不(bu)使用(yong)洗脫(tuo)緩(huan)沖液(ye)(ye)(ye)(ye)，而(er)使用(yong)去離子(zi)水(shui)(shui)，比(bi)值(zhi)會(hui)偏(pian)低，因(yin)為(wei)pH值(zhi)和離子(zi)存(cun)在(zai)會(hui)影(ying)響光吸(xi)收(shou)值(zhi)，但并不(bu)表示純度低。 6. 在(zai)確保(bao)樣品(pin)無誤的(de)(de)情況(kuang)下，如經過(guo)(guo)多次試驗(yan)，都無法提(ti)出DNA，請(qing)將部(bu)分樣品(pin)寄我(wo)公司，我(wo)們代為(wei)摸(mo)索優化條件，以(yi)使您的(de)(de)實驗(yan)能夠正常進行(xing)下去。

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