線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ活性檢測試劑盒

產(chan)品英文名:Micro Mitochondrial Respiratory Chain ComplexⅠActivity Assay Kit

產品貨號：BC0515                產地：北京(jing)市(shi)通州區馬(ma)駒橋聯東U谷8三樓

產品規格：100管/96樣(yang)            產(chan)品商標：solarbio
保(bao)(bao)存(cun)(cun)與運輸：4℃保(bao)(bao)存(cun)(cun)或(huo)-20℃保(bao)(bao)存(cun)(cun)；           ; 參考價格：2800
庫存狀態：現貨                          
關鍵字：：   ：  ：  線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ檢測試劑盒|  線粒(li)體呼吸(xi)鏈復合體Ⅰ|線粒體呼(hu)吸鏈(lian)|試劑(ji)盒(he)

簡要(yao)介紹：
復(fu)合體Ⅰ（EC 1.6.5. 3）又(you)稱 NADH-CoQ 還原酶或(huo) NADH 脫氫酶，廣泛存在于動物、植物、 微生(sheng)(sheng)(sheng)物和(he)培(pei)養細(xi)胞的線粒(li)體中，是線粒(li)體內膜中大(da)的蛋(dan)白復(fu)合物。該酶催(cui)化(hua)一對電子從 NADH 傳遞給(gei) CoQ，同時可使O2還原生(sheng)(sheng)(sheng)成 O2.-，是呼吸(xi)電子傳遞鏈(lian)上產生(sheng)(sheng)(sheng)O2.-的主要(yao)部位。 測定該酶活性，不(bu)僅可以(yi)反映(ying)呼吸(xi)電子傳遞鏈(lian)（ETC）狀態，而且可以(yi)反映(ying)活性氧(yang)（ROS） 生(sheng)(sheng)(sheng)成狀態。

產(chan)品詳細描述(shu)
產品內(nei)容：
提取液：液體(ti)100mL×1瓶，4℃保存(cun)；  
試劑一：液體20 mL×1瓶，4℃保存(cun)；
試劑(ji)二：粉劑(ji)×1支(zhi)，4℃保存；臨用前加入1mL丙tong。
試(shi)劑三：粉劑×1 支，-20℃保存；溶于1mL丙(bing)tong，可分裝(zhuang)后(hou)-20℃保存。臨用(yong)前再用(yong)丙(bing)tong100倍稀(xi)釋后(hou)使(shi)用(yong)，現(xian)用(yong)現(xian)配。
試劑四：粉劑×1支(zhi)，-20℃保(bao)存；臨用前加入2mL蒸(zheng)餾水，現配現用；   
工作液的配(pei)制：臨用前將試(shi)劑二和(he)試(shi)劑三1:1混合，現配(pei)現用。
產品說明：
復(fu)合體Ⅰ（EC 1.6.5. 3）又稱(cheng)NADH-CoQ 還(huan)原酶或(huo)NADH脫氫酶，廣泛存在于動(dong)物、植物、微生(sheng)物和培養細(xi)胞(bao)的(de)線粒體中，是線粒體內(nei)膜中大(da)的(de)蛋(dan)白復(fu)合物。該酶催(cui)化一(yi)對電子從NADH傳遞給CoQ，同時(shi)可使O₂還原生成O^2-，是呼吸電子傳遞鏈上(shang)產生O^2.-的主要部位。測定該(gai)酶活性，不僅可以反(fan)映呼吸電子(zi)傳遞鏈(lian)（ETC）狀(zhuang)態(tai)，而且(qie)可以反(fan)映活性氧（ROS）生成狀(zhuang)態(tai)。
復合體Ⅰ能夠催(cui)化NADH脫氫生成(cheng)NAD⁺，在340nm下測定NADH的(de)氧化速(su)率計(ji)算出該酶(mei)活性的(de)大小。
試(shi)驗中所需的儀器和試(shi)劑：
紫外分光光度計/酶標儀(yi)、臺式離心機、水(shui)浴(yu)鍋、可調式移液(ye)器(qi)、微量石英比色皿/石英96孔板 、研缽/勻漿器(qi)、丙tong、冰和蒸(zheng)餾水(shui)。
操(cao)作步驟：
一、復合體(ti)的提取： 

1. 稱取約0.1g組織或收集500萬細胞(bao)，加(jia)入1.0 mL提取液，用勻漿器或研缽于冰上勻漿。
2. 4 ℃ 600 g離(li)心10min。
3. 將上清液移(yi)另一離心管中(zhong)，4 ℃ 11000 g離心15min。
4. 上清(qing)液(ye)即胞漿(jiang)提(ti)取物，可用于測定(ding)從線粒體泄漏的復合體Ⅰ（此步(bu)可選做，可以判斷線粒體提(ti)取效果(guo)）。
5. 在(zai)沉(chen)淀中加入(ru)400μL提取液，超(chao)聲波(bo)破碎（功(gong)率20％，超(chao)聲5秒，間隔10秒，重復(fu)15次(ci)），用于(yu)復(fu)合體Ⅰ酶活(huo)性測(ce)定(ding)，并且用于(yu)蛋白含量測(ce)定(ding)。

二、測(ce)定步(bu)驟：

1. 紫外(wai)分光光度計預熱30min 以上，調節波長340nm，蒸餾水調零。
2. 試劑一37℃（哺乳動(dong)物）或25℃（其他物種）預(yu)熱15min。
3. 操(cao)作表：在(zai)微量石英(ying)比色(se)皿/石英(ying)96孔板中分(fen)別(bie)加(jia)入

三(san)、復合體(ti)Ⅰ活力單位的計算：  
（1）以微量石(shi)英比色皿(min)計(ji)算：
單位(wei)定(ding)義：每mg 組織蛋白每分鐘(zhong)消耗1 nmol 的NADH 定(ding)義為一個酶活力單位(wei)。
復合體Ⅰ活(huo)力（U/mg prot）=[ΔA×V 反總(zong)÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T =1608×;ΔA÷Cpr
V 反(fan)總(zong)：反(fan)應(ying)體系總(zong)體積，2×10^-4 L；ε：NADH 摩爾消(xiao)光系數，6.22×10³ L / mol /cm；d：比(bi)色(se)皿光徑(jing)，1cm；V 樣：加入樣本(ben)體(ti)積，0.01 mL； T：反應時間，2min；Cpr：樣本(ben)蛋白質濃度，mg/mL。
（2）以96孔板計算：將上述公式中的(de)d-1cm改為d-0.6cm進行計算即可。
注意事項(xiang)：

1. 為保證實(shi)驗結(jie)果的準確性，需先取1-2個樣(yang)做(zuo)預實(shi)驗，如果測(ce)定(ding)的吸光值過高(gao)（高(gao)于1.5），可(ke)用蒸餾水稀釋(shi)上清液后(hou)再測(ce)定(ding)。計算結(jie)果時注意乘以稀釋(shi)倍數。若ΔA大于0.4，需將樣(yang)本稀釋適當倍數（計(ji)算公式中乘以(yi)相應稀釋倍數）；若ΔA偏(pian)小，則可以(yi)通過(guo)增加加入的樣(yang)品體積(ji)來提(ti)高(gao)靈敏度。
2. 樣品蛋(dan)白(bai)濃(nong)度需自行測定(ding)，推(tui)薦我公司BCA蛋(dan)白(bai)濃(nong)度測定(ding)試劑盒(he)。由于提(ti)取(qu)液中含有(you)蛋(dan)白(bai)，所以(yi)在測定(ding)樣品蛋(dan)白(bai)濃(nong)度時需要(yao)減去提(ti)取(qu)液本(ben)身的(de)蛋(dan)白(bai)含量(liang)。
3. 推薦使用(yong)樣本(ben)蛋(dan)白濃度計算(suan)酶活，若用(yong)樣本(ben)鮮重(zhong)計算(suan)，則需加測(ce)胞漿提取物酶活，上清(qing)和沉淀酶活之和方為(wei)總酶活。
4. 本試劑盒試劑足夠完成25管反應。
5. 附:使用樣本重量計算(suan)公(gong)式(shi)：（樣本檢測數為25T/12S）

A、上清中復合(he)體I活力的計算:
按樣本(ben)鮮重計(ji)算：
單位的定義：每g組織在反應體系中每(mei)分鐘消耗1 nmol NADH定(ding)義(yi)為(wei)一(yi)個酶活力單(dan)位。
復(fu)合體I活性（U/g）= [ΔA1×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W÷V提取×V樣)÷T
                   =1608×ΔA1÷W。
ΔA1：上清測(ce)定(ding)值；V 反總：反應體(ti)系總體(ti)積(ji)，10^-3 L；ε：NADH 摩爾消(xiao)光系數，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V提取(qu)：加入提取(qu)液體積(ji)，1mL ；V 樣(yang)(yang)：加入樣(yang)(yang)本體積(ji)，0.05mL；T：反應時間，2 min；W：樣(yang)(yang)本重量，g。
B、沉(chen)淀中復合體I活力的計(ji)算:
按樣本鮮重(zhong)計算：
單位的定義：每g組(zu)織在反應體(ti)系(xi)中(zhong)每分鐘(zhong)消(xiao)耗1 nmol NADH定義為一(yi)個酶活(huo)力單位。
復合(he)體I活性（U/g）= [ΔA2×;V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W÷V提取×V樣本)）÷T
                   =643×ΔA2÷W。
ΔA2：沉淀測定值(zhi)；V 反總：反應體系(xi)總體積，10^-3 L；ε：NADH 摩(mo)爾消光系數，6.22×10³ L / mol /cm d：比色皿光徑，1cm；V提取(qu)：沉淀重懸體積(ji)，0.4mL ；V 樣：加入樣本體積，0.05mL；T：反應(ying)時(shi)間，2 min；W：樣本重量，g。
C、樣本復合體I總活(huo)力的計算:
樣本復合體I總活力即為上清中復(fu)合體(ti)I活力與沉淀中(zhong)復合體I活(huo)力之和。
按樣本鮮重計算(suan)：
復合體I（U/g 鮮重）=1608×;ΔA1÷W +643×ΔA2÷;W。

相關文獻：
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線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ活性檢測試劑盒