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特級馬血清 索萊寶

血(xue)清通常(chang)作為補充成分(fen)添加(jia)在基礎(chu)培養(yang)(yang)(yang)基內(nei)使用。它能(neng)夠提供(gong)各種大分(fen)子(zi)(zi)蛋(dan)白(bai)，小分(fen)子(zi)(zi)量營養(yang)(yang)(yang)，水溶(rong)性成分(fen)的轉運蛋(dan)白(bai)，和(he)其它一些(xie)細(xi)胞(bao)在體外(wai)所必需的成分(fen)，如激素和(he)附(fu)著因子(zi)(zi)。血(xue)清可以結合或中(zhong)和(he)一些(xie)生(sheng)長因子(zi)(zi)中(zhong)的有毒成分(fen)，并提供(gong)培養(yang)(yang)(yang)基的緩沖能(neng)力。細(xi)胞(bao)培養(yang)(yang)(yang)時血(xue)清的添加(jia)依(yi)賴于基礎(chu)培養(yang)(yang)(yang)基的化學組(zu)成，培養(yang)(yang)(yang)細(xi)胞(bao)的類型(xing)，及所用的培養(yang)(yang)(yang)系統。

我們在提供細胞培(pei)養(yang)基、平(ping)衡鹽溶液(ye)、無血(xue)(xue)(xue)清(qing)培(pei)養(yang)基和試劑的同(tong)時(shi)，還提供高品(pin)(pin)(pin)質(zhi)(zhi)(zhi)的血(xue)(xue)(xue)清(qing)。我們對血(xue)(xue)(xue)清(qing)制備進行全(quan)過程(cheng)監管(guan)。從血(xue)(xue)(xue)清(qing)收(shou)集(ji)到(dao)終產(chan)品(pin)(pin)(pin)檢驗和內部稽(ji)核(he)的每一個(ge)步驟，我們都采用設(she)備和標準操(cao)作程(cheng)序(xu)，以(yi)確(que)保整(zheng)(zheng)個(ge)過程(cheng)中每個(ge)環節的產(chan)品(pin)(pin)(pin)質(zhi)(zhi)(zhi)量。對整(zheng)(zheng)個(ge)過程(cheng)的控制可(ke)以(yi)保證產(chan)品(pin)(pin)(pin)的持續(xu)高品(pin)(pin)(pin)質(zhi)(zhi)(zhi)，降低不同(tong)批(pi)次的差異。

處(chu)理：全部血(xue)清(qing)(qing)：收集的(de)(de)血(xue)液均在冷藏條件下處(chu)理。血(xue)清(qing)(qing)和血(xue)分離后立即將(jiang)血(xue)清(qing)(qing)合并并冷凍。只(zhi)有符合我們的(de)(de)檢測標準的(de)(de)血(xue)清(qing)(qing)才被接受作進一步處(chu)理。

熱(re)滅(mie)活血(xue)(xue)清(qing)(qing)：熱(re)滅(mie)活是(shi)在56℃水浴中嚴(yan)格控(kong)溫30分鐘。透(tou)析(xi)(xi)(xi)血(xue)(xue)清(qing)(qing)：用(yong)10,000截(jie)留分子(zi)量的(de)(de)(de)透(tou)析(xi)(xi)(xi)膜在0.15M的(de)(de)(de)NaCl中進行(xing)透(tou)析(xi)(xi)(xi)，直到葡(pu)萄糖水平(ping)低于5mg/dl(用(yong)鄰甲(jia)苯胺測試法檢驗)。γ射(she)(she)線照射(she)(she)血(xue)(xue)清(qing)(qing)：可(ke)按(an)客戶要求(qiu)對血(xue)(xue)清(qing)(qing)進行(xing)γ射(she)(she)線照射(she)(she)。通(tong)過(guo)γ射(she)(she)線照射(she)(she)以滅(mie)活各種動物血(xue)(xue)清(qing)(qing)(包括胎牛血(xue)(xue)清(qing)(qing)、新生牛血(xue)(xue)清(qing)(qing)、豬(zhu)血(xue)(xue)清(qing)(qing)和(he)(he)馬血(xue)(xue)清(qing)(qing))中的(de)(de)(de)病毒和(he)(he)支原(yuan)體的(de)(de)(de)方法已經得到證實。研究證實照射(she)(she)劑量在30-45kGy為宜。血(xue)(xue)清(qing)(qing)在此照射(she)(she)后(hou)物理(li)化(hua)學特性和(he)(he)細胞培養(yang)表(biao)現沒有變化(hua)。裝瓶：粗血(xue)(xue)清(qing)(qing)須通(tong)過(guo)一(yi)系列的(de)(de)(de)過(guo)濾(lv)才成(cheng)為成(cheng)品。后(hou)的(de)(de)(de)過(guo)濾(lv)步驟包括使用(yong)0.2um和(he)(he)0.1um的(de)(de)(de)無菌過(guo)濾(lv)。胎牛血(xue)(xue)清(qing)(qing)須通(tong)過(guo)三次(ci)0.1um過(guo)濾(lv)，其他血(xue)(xue)清(qing)(qing)須通(tong)過(guo)0.2um過(guo)濾(lv)。終產(chan)品的(de)(de)(de)質(zhi)量控(kong)制：我們采取以下方法對每一(yi)批(pi)次(ci)的(de)(de)(de)產(chan)品選取一(yi)定數量的(de)(de)(de)樣(yang)品進行(xing)質(zhi)量控(kong)制分析(xi)(xi)(xi)：

化學(xue)檢測：使用低溫凝(ning)固點的(de)(de)方法(fa)檢測滲透壓(ya)，以保證(zheng)符合(he)產品規范(fan)。我(wo)們(men)每(mei)(mei)天使用國家標準(zhun)(zhun)的(de)(de)技術(shu)(shu)研(yan)究所(suo)標定(ding)的(de)(de)標準(zhun)(zhun)溶液(ye)對(dui)我(wo)們(men)的(de)(de)滲透壓(ya)檢測儀(yi)器進行(xing)校準(zhun)(zhun)。同(tong)樣每(mei)(mei)天使用國家標準(zhun)(zhun)技術(shu)(shu)研(yan)究所(suo)標定(ding)的(de)(de)標準(zhun)(zhun)溶液(ye)對(dui)pH計(ji)進行(xing)校準(zhun)(zhun)。

使用電泳圖譜鑒定血清的整體(ti)(ti)性質。樣品被轉移(yi)到(dao)硝酸纖(xian)維(wei)素基質中，并在緩沖體(ti)(ti)系內遷(qian)移(yi)。條(tiao)帶經(jing)染色、清潔、干燥后用密度儀進(jin)行(xing)(xing)掃描，以檢測(ce)白(bai)蛋白(bai)和(he)(he)球(qiu)蛋白(bai)組分的相對(dui)濃度。為(wei)證實是(shi)否(fou)在適當(dang)的條(tiao)件(jian)下(xia)進(jin)行(xing)(xing)采血和(he)(he)處理(li)，使用修飾的Fleming方法對(dui)血紅(hong)蛋白(bai)進(jin)行(xing)(xing)分光(guang)(guang)光(guang)(guang)度檢測(ce)。

隨著動(dong)物年齡(ling)的(de)(de)(de)(de)增(zeng)加，血清總(zong)蛋白(bai)含量也相應地提高。使用(yong)自動(dong)化的(de)(de)(de)(de)Biuret方法進(jin)行總(zong)血清蛋白(bai)的(de)(de)(de)(de)檢測，以確認動(dong)物年齡(ling)并驗(yan)證(zheng)符合產品規范。使用(yong)色度(du)計在不同波長下檢測樣(yang)品和Biuret試(shi)劑混合波的(de)(de)(de)(de)吸光度(du)。自動(dong)計算結果后(hou)，與標(biao)準(zhun)曲線比(bi)較，即(ji)可得到(dao)蛋白(bai)值(zhi)(克/公升)。

穩定(ding)性檢測程(cheng)序：在(zai)每一個(ge)標記為(wei)體外(wai)診(zhen)斷的產(chan)(chan)品(pin)上(shang)顯示的效(xiao)期表明了這個(ge)產(chan)(chan)品(pin)具有(you)多長時間的效(xiao)能。我們(men)(men)的穩定(ding)性程(cheng)序確(que)定(ding)和證明了產(chan)(chan)品(pin)效(xiao)期。我們(men)(men)定(ding)期監測批量產(chan)(chan)品(pin)，確(que)定(ding)產(chan)(chan)品(pin)在(zai)推薦貯存條件下具有(you)可接受(shou)效(xiao)果的時間長度。

微生物學檢(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)：所(suo)有(you)血清使(shi)(shi)用(yong)Barile&Kern的(de)大體(ti)積方(fang)法(fa)檢(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)支(zhi)原體(ti)。在(zai)(zai)推薦方(fang)法(fa)的(de)檢(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)范(fan)圍內檢(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)結果是準確的(de)。樣(yang)品少應該在(zai)(zai)肉(rou)(rou)湯中(zhong)合(he)并培(pei)(pei)養3個星(xing)期(qi)(qi)，同時要(yao)(yao)在(zai)(zai)瓊(qiong)脂平(ping)(ping)板(ban)上(shang)進(jin)行不(bu)少于(yu)4次(ci)傳代(dai)培(pei)(pei)養。在(zai)(zai)有(you)氧(yang)和厭氧(yang)(95%氮，5%CO2)條件下(xia)，平(ping)(ping)板(ban)在(zai)(zai)36±2℃下(xia)孵育。在(zai)(zai)檢(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)過程中(zhong)，每(mei)周對(dui)瓊(qiong)脂平(ping)(ping)板(ban)進(jin)行一次(ci)微生物生長情況檢(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)驗(yan)。使(shi)(shi)用(yong)Dienes染(ran)色法(fa)對(dui)懷疑被污(wu)染(ran)的(de)瓊(qiong)脂平(ping)(ping)板(ban)進(jin)行支(zhi)原體(ti)菌落的(de)檢(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)。然后，對(dui)平(ping)(ping)板(ban)進(jin)行再(zai)次(ci)鏡檢(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)。對(dui)孵育肉(rou)(rou)湯瓶要(yao)(yao)定期(qi)(qi)進(jin)行濁度和pH值變動的(de)檢(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)。在(zai)(zai)推薦方(fang)法(fa)檢(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)范(fan)圍內，所(suo)有(you)血清也要(yao)(yao)使(shi)(shi)用(yong)Hoechst熒光DNA染(ran)色法(fa)進(jin)行不(bu)可在(zai)(zai)肉(rou)(rou)湯中(zhong)培(pei)(pei)養的(de)支(zhi)原體(ti)(包括M.hyorhinis屬)檢(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)。

病(bing)毒檢測(ce)：已知無外來物質的(de)(de)細胞(bao)(bao)培(pei)養(yang)基須經過在包含(han)15%測(ce)試血清(qing)的(de)(de)生長培(pei)養(yang)基中進(jin)行為期21天的(de)(de)三次(ci)傳(chuan)代培(pei)養(yang)。使用對照(zhao)培(pei)養(yang)基和(he)已知對外來物質為陰性(xing)的(de)(de)血清(qing)平行地維(wei)持(chi)陰性(xing)對照(zhao)培(pei)養(yang)。整個期間，檢測(ce)所有(you)(you)的(de)(de)培(pei)養(yang)情況(kuang)，以便發現(xian)是(shi)否存在病(bing)毒誘發的(de)(de)細胞(bao)(bao)形(xing)態改(gai)變或致細胞(bao)(bao)病(bing)變效(xiao)應。在1421天的(de)(de)培(pei)養(yang)期間，對含(han)有(you)(you)檢測(ce)血清(qing)的(de)(de)平行培(pei)養(yang)瓶按下面標準病(bing)毒檢測(ce)方法進(jin)行評(ping)估。

將(jiang)其(qi)中一瓶(ping)檢測細胞(bao)用胰(yi)蛋(dan)白酶消化，然后(hou)把(ba)細胞(bao)分別加(jia)(jia)入到總(zong)面(mian)積為6cm 2 的六室載玻片上。同時準備陰性對照(zhao)載玻片。在(zai)檢測培(pei)養(yang)的單室載玻片上加(jia)(jia)入牛病(bing)(bing)毒(du)性腹(fu)瀉病(bing)(bing)毒(du)(BVDV)、牛細小病(bing)(bing)毒(du)、牛腺病(bing)(bing)毒(du)、狂犬病(bing)(bing)毒(du)和呼腸病(bing)(bing)毒(du)的染色劑，作(zuo)為單個的陽性對照(zhao)。再經(jing)過7天培(pei)養(yang)(總(zong)共21天)，利用熒(ying)光(guang)抗體技(ji)術檢測病(bing)(bing)毒(du)。

通過對(dui)檢測培養進行蘇木精伊紅染色(se)，觀察致細胞突(tu)變效(xiao)應(ying)(CPE)或其他病毒誘導(dao)效(xiao)應(ying)。檢測細胞是否存在CPE效(xiao)應(ying)、內含物、多核體(ti)或其他異常效(xiao)應(ying)。

內毒素檢測：我(wo)們用阿米巴變形細胞(bao)溶解(jie)物(LAL)凝(ning)膠法來檢測胎(tai)牛血(xue)清的內毒素含量。

效能檢測：
對每一批次的胎牛血(xue)清，我們都(dou)進行(xing)下述培(pei)養(yang)效(xiao)能檢測。選擇(ze)血(xue)清重要的標準(zhun)是其支持(chi)特殊(shu)細胞的生長能力。因此(ci)，除了保證血(xue)清通過嚴格的品質(zhi)控制，我們也同時在實驗室條件(jian)下對血(xue)清的三個重要的培(pei)養(yang)效(xiao)能進行(xing)檢測：克隆效(xiao)率、貼壁(bi)效(xiao)果和二倍體成纖(xian)維(wei)細胞生長促進。

克隆效率分析：克隆效率實驗分析每一批胎牛血清促進小鼠骨髓瘤細胞及其衍生的雜交瘤細胞的克隆和生長能力。下列產品
經驗證可用于該實驗：
Sp2/0-Ag14(ATCC #CRL 1581)
P3x63-Ag8.653(ATCC #CRL 1580)

每(mei)一批胎牛血(xue)(xue)清(qing)(qing)都要(yao)分(fen)別在(zai)(zai)復制微量(liang)(liang)滴(di)定平板(ban)上加入兩種血(xue)(xue)清(qing)(qing)濃度和(he)兩種細(xi)胞接種量(liang)(liang)(10%血(xue)(xue)清(qing)(qing)和(he)1cell/孔(kong)(kong)，4%血(xue)(xue)清(qing)(qing)和(he)5cells/孔(kong)(kong))的(de)(de)情況下進行分(fen)析(xi)。克隆分(fen)析(xi)結(jie)果除以(yi)已確定的(de)(de)參照血(xue)(xue)清(qing)(qing)值(zhi)得(de)以(yi)歸一化。在(zai)(zai)許多日常雜交選擇(ze)程序(xu)中(zhong)具有代表性的(de)(de)是(shi)高濃度的(de)(de)血(xue)(xue)清(qing)(qing)，而低濃度血(xue)(xue)清(qing)(qing)在(zai)(zai)設計血(xue)(xue)清(qing)(qing)批次細(xi)微差異(yi)放大檢測(ce)(ce)中(zhong)有更為(wei)嚴(yan)格的(de)(de)測(ce)(ce)試。嚴(yan)格的(de)(de)1cell/孔(kong)(kong)測(ce)(ce)試是(shi)模擬單一雜交選擇(ze)的(de)(de)實驗室條(tiao)件。為(wei)每(mei)一批次胎牛血(xue)(xue)清(qing)(qing)提供的(de)(de)分(fen)析(xi)證明(ming)報告中(zhong)的(de)(de)克隆效率值(zhi)為(wei)兩次測(ce)(ce)試條(tiao)件下的(de)(de)平均值(zhi)。

克隆分析法：克隆分析法是在復式96孔板中加入兩種胎牛血清濃度(10%v/v)和(4%v/v)和兩種接種量的情況下進行的。每一次化驗中，同時測量前期已驗證合格的一批胎牛血清，并將此測量值作為內部參考標準。
克隆分析(xi)按下述方法進行：

1．Sp2/0-Ag14(sp2)和P3x63-Ag8.653(653)在(zai)含有10%的(de)胎牛血(xue)清的(de)RPM1640中通常保(bao)持(chi)對數生長(chang)期。在(zai)顯微(wei)鏡(jing)下，利用臺盼藍排除法(fa)對活細胞(bao)進行計數。

2．用RPM1640培(pei)養(yang)(yang)基將儲備細胞(bao)懸浮液進行(xing)連續(xu)稀釋，使(shi)其(qi)達到預(yu)期(qi)的(de)25cells/ml和5cells/ml接(jie)種濃度(du)。準(zhun)備含有(you)參照或測試胎牛血清(qing)的(de)RPM1640培(pei)養(yang)(yang)基。將這種密度(du)的(de)細胞(bao)分配到各(ge)個分析生長培(pei)養(yang)(yang)基體積為0.2毫升的(de)孔中，使(shi)其(qi)分別(bie)平均含有(you)5個和1個細胞(bao)。

3．將96孔板放入(ru)36±2℃，4-6% CO 2 的(de)潮濕培養箱孵(fu)育約1015天。

4．在孵育期間(jian)，用(yong)肉(rou)眼觀察平(ping)板(ban)并(bing)對用(yong)于克隆(long)(long)的孔(kong)進行(xing)計數(shu)。克隆(long)(long)效(xiao)率按下列(lie)方法(fa)計算：克隆(long)(long)效(xiao)率=(陽(yang)性孔(kong)平(ping)均數(shu)/孵育孔(kong)總數(shu))×100%

5．每(mei)一批(pi)次胎牛血清維持指(zhi)示劑骨髓瘤細(xi)胞克(ke)(ke)隆效(xiao)(xiao)(xiao)率的(de)(de)定(ding)量按照(zhao)以下方法測(ce)得的(de)(de)相對克(ke)(ke)隆效(xiao)(xiao)(xiao)率(RCE)進行歸一化：RCE=檢(jian)測(ce)血清的(de)(de)克(ke)(ke)隆效(xiao)(xiao)(xiao)率/對照(zhao)血清的(de)(de)克(ke)(ke)隆效(xiao)(xiao)(xiao)率貼(tie)壁(bi)效(xiao)(xiao)(xiao)率分(fen)析(xi)：貼(tie)壁(bi)效(xiao)(xiao)(xiao)率分(fen)析(xi)是(shi)利(li)用已轉型的(de)(de)人類細(xi)胞系(xi)來檢(jian)測(ce)每(mei)一批(pi)血清促使持續貼(tie)附細(xi)胞系(xi)的(de)(de)生(sheng)長(chang)能力(li)。選擇已被驗證可(ke)以檢(jian)測(ce)貼(tie)壁(bi)效(xiao)(xiao)(xiao)率的(de)(de)細(xi)胞系(xi)A549(人肺腫瘤細(xi)胞，ATCC#CCL,185)，是(shi)因為它可(ke)以區分(fen)一批(pi)血清維持細(xi)胞貼(tie)壁(bi)和繁殖能力(li)的(de)(de)細(xi)微差異。

每一批次(ci)胎牛血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)都要在(zai)兩種(zhong)血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)濃度和(he)兩種(zhong)細胞接種(zhong)濃度下(10%血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)和(he)100cells/孔(kong)，4%血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)和(he)200cells/孔(kong))測(ce)試(shi)三次(ci)。在(zai)36±2℃，4-6% CO 2 的(de)(de)(de)(de)(de)潮濕(shi)培養箱(xiang)孵育(yu)約1014天，對(dui)被染色的(de)(de)(de)(de)(de)細胞菌(jun)落進(jin)行計數即可(ke)得到(dao)其貼壁效(xiao)(xiao)率(lv)(lv)。將結(jie)果(guo)除以(yi)(yi)參考的(de)(de)(de)(de)(de)對(dui)照(zhao)血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)得以(yi)(yi)歸一化。通過(guo)兩種(zhong)血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)濃度的(de)(de)(de)(de)(de)測(ce)試(shi)，可(ke)以(yi)(yi)驗證該批次(ci)血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)在(zai)減量和(he)標(biao)準水平下維持(chi)生(sheng)長的(de)(de)(de)(de)(de)能力(li)。為(wei)每一批次(ci)胎牛血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)提供的(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)析證明報告中的(de)(de)(de)(de)(de)貼壁效(xiao)(xiao)率(lv)(lv)值為(wei)兩次(ci)測(ce)試(shi)條件下的(de)(de)(de)(de)(de)平均值。

貼壁分(fen)析法：使用(yong)貼附(fu)分(fen)析檢(jian)測(ce)上述(shu)每(mei)一(yi)(yi)(yi)批(pi)測(ce)試(shi)血清。這種分(fen)析法針對每(mei)一(yi)(yi)(yi)個(ge)血清樣品使用(yong)一(yi)(yi)(yi)個(ge)6孔板(ban)(每(mei)室(shi)9.6cm 2 )，并可以對三個(ge)孔的數據進行平均處理(li)。每(mei)一(yi)(yi)(yi)次化驗中，同時(shi)測(ce)量(liang)前期已驗證合(he)格的一(yi)(yi)(yi)批(pi)胎(tai)牛(niu)血清，并將此(ci)測(ce)量(liang)值作為(wei)內(nei)部參考(kao)標準。

貼附分析按下述方(fang)法進行：

1．A549細胞系用含有10%胎牛(niu)血(xue)清的(de)DMEM培養基(ji)，在36±2℃，以亞融合密(mi)度(du)下(xia)進行培養。

2．含(han)10%(v/v)和(he)4%(v/v)血清(qing)的DMEM由分(fen)別在(zai)22.5毫升和(he)24毫升DMEM中加(jia)入2.5毫升和(he)1毫升胎牛血清(qing)配(pei)制而(er)成，終有(you)效(xiao)體積為25毫升。將(jiang)5毫升含(han)血清(qing)培養(yang)基分(fen)別加(jia)入6孔板的每(mei)一(yi)個(ge)孔中。

3．A549培養細(xi)胞(bao)先(xian)經過胰蛋白酶(mei)消化，測定活(huo)細(xi)胞(bao)數，然后稀釋(shi)細(xi)胞(bao)懸浮液2,000cells/ml。

4．將0.1毫(hao)升細胞懸浮(fu)液加入200cells/孔室中，0.05毫(hao)升懸浮(fu)液加入100cells/孔室中。平板(ban)混合(he)后放入36±2℃，5%CO 2 的潮濕培養(yang)箱孵育約1014天。

5．孵育后，取出平板，去除生長培養基，用(yong)亞甲基蘭-甲醇溶液(ye)對菌(jun)落進行染色。

6．計(ji)算菌落(luo)形成(cheng)，然后按下述方法計(ji)算貼壁(bi)效(xiao)率：%貼壁(bi)效(xiao)率=每孔菌落(luo)平均數(shu)/每孔孵育活細胞平均數(shu)×100

7．為方便比(bi)較，將測(ce)得(de)的(de)(de)貼(tie)(tie)壁(bi)效(xiao)(xiao)率數值(zhi)除以(yi)每批檢測(ce)血清的(de)(de)相(xiang)對貼(tie)(tie)壁(bi)效(xiao)(xiao)率(RPE)得(de)以(yi)歸一化(hua)：RCE=檢測(ce)血清的(de)(de)貼(tie)(tie)壁(bi)效(xiao)(xiao)率/參照血清的(de)(de)貼(tie)(tie)壁(bi)效(xiao)(xiao)率二(er)倍體成(cheng)纖維(wei)細(xi)胞生長：促進生長分(fen)析用(yong)于檢測(ce)每一批胎牛血清維(wei)持難培(pei)養的(de)(de)人二(er)倍體成(cheng)纖維(wei)細(xi)胞長期生長的(de)(de)能力。

下(xia)列細(xi)胞(bao)系經認證(zheng)可用(yong)于該實驗：

WI-38(人二倍體肺成纖維細胞，ATCC#CCL 75)

WI-38細(xi)胞在含(han)5%胎(tai)牛血(xue)清的(de)低密度(2X10 5 /瓶)復(fu)式25-cm 2瓶中孵(fu)(fu)育，并進(jin)行為(wei)(wei)(wei)期(qi)三(san)個連續7天的(de)傳(chuan)代培(pei)養(yang)(yang)(yang)。在每一個培(pei)養(yang)(yang)(yang)期(qi)，細(xi)胞都從初始孵(fu)(fu)育密度開始傳(chuan)代培(pei)養(yang)(yang)(yang)。壓(ya)力分層率、成倍繁殖數量和(he)減量血(xue)清濃度是每批次(ci)促進(jin)難培(pei)養(yang)(yang)(yang)二倍體細(xi)胞的(de)生長(chang)血(xue)清的(de)嚴格(ge)測(ce)試指標。通過(guo)連續三(san)代培(pei)養(yang)(yang)(yang)以減少前一次(ci)生長(chang)培(pei)養(yang)(yang)(yang)基的(de)殘留影(ying)響，從而保證(zheng)得到檢(jian)測(ce)批促進(jin)生長(chang)能力的(de)真(zhen)實(shi)結果。為(wei)(wei)(wei)每一批次(ci)胎(tai)牛血(xue)清提供(gong)的(de)分析證(zheng)明報告為(wei)(wei)(wei)第(di)三(san)次(ci)傳(chuan)代培(pei)養(yang)(yang)(yang)每復(fu)式培(pei)養(yang)(yang)(yang)瓶細(xi)胞數的(de)平均(jun)值。將檢(jian)測(ce)值除以參考對照值得以歸一化。

二(er)倍(bei)體(ti)成(cheng)纖維細(xi)(xi)胞生長分析法：培(pei)養數(shu)代WI-38人(ren)類(lei)二(er)倍(bei)體(ti)肺成(cheng)纖維細(xi)(xi)胞，計(ji)算每一代的(de)(de)細(xi)(xi)胞總數(shu)。此項檢測所挑選出的(de)(de)胎牛(niu)血清批號能維持難以生長細(xi)(xi)胞、貼(tie)壁性細(xi)(xi)胞、正常的(de)(de)細(xi)(xi)胞株生長及(ji)存(cun)活。

1．準(zhun)備含(han)5%檢測血(xue)清(qing)或(huo)已驗證合格的參照(zhao)血(xue)清(qing)生長(chang)(chang)培(pei)養基，基礎生長(chang)(chang)培(pei)養基為含(han)L-谷氨酰胺的HBME：EBME(1：1)。按要(yao)求，在每一次流量變化和分(fen)析過程中進(jin)行傳代培(pei)養時(shi)需配制(zhi)含(han)5%血(xue)清(qing)生長(chang)(chang)的培(pei)養基。

2．在低代培養水平時(shi)，將(jiang)(jiang)2X10 5 WI-38細(xi)胞(bao)加入各個含(han)9.5毫升生長培養基的(de)復式25-cm 2 培養基中(zhong)。在不擰緊瓶蓋的(de)情況下，將(jiang)(jiang)培養瓶放入4-6%CO 2， 36℃±2℃環境中(zhong)，保(bao)持24小時(shi)。然(ran)后擰緊瓶蓋，將(jiang)(jiang)培養瓶放在36℃±2℃下孵(fu)育7天，在第2天或第3天全部更換培養基。

3．在第(di)7天，用胰蛋白酶(mei)對(dui)每一(yi)(yi)個(ge)含參(can)照(zhao)或(huo)檢(jian)測(ce)血清(qing)的(de)復式瓶(ping)中的(de)細胞進行(xing)消化得到一(yi)(yi)定數(shu)量細胞，然后(hou)合并并計數(shu)。將2x10 5 WI-38細胞加入含有(you)新鮮生長(chang)培養基(ji)(已(yi)加入了與上(shang)一(yi)(yi)代同一(yi)(yi)批次的(de)參(can)照(zhao)或(huo)檢(jian)測(ce)胎牛(niu)血清(qing))的(de)新的(de)復式25-cm 2 瓶(ping)中，進行(xing)細胞傳代培養。按第(di)2步所述(shu)，將培養瓶(ping)進行(xing)平衡并孵育(yu)。

4．如上所述經過三代(dai)(dai)(dai)連續(xu)分析，在(zai)每一(yi)代(dai)(dai)(dai)結(jie)束時計算每一(yi)批參照(zhao)(zhao)或(huo)檢測血(xue)清的每瓶細胞平均數(shu)。后一(yi)代(dai)(dai)(dai)培養的各批檢測血(xue)清實驗(yan)中的相對(dui)生長(chang)率(RGR)作為參照(zhao)(zhao)血(xue)清實驗(yan)中獲得的細胞生長(chang)率分子(zi)：

%RGR=檢測(ce)血清(qing)實(shi)驗(yan)中(zhong)每瓶(ping)平均細胞(bao)數/參照血清(qing)實(shi)驗(yan)中(zhong)每瓶(ping)平均細胞(bao)數X100S f9細胞(bao)生長(chang)(chang)促進分(fen)析(xi)(xi)。通過昆蟲分(fen)析(xi)(xi)可以(yi)(yi)(yi)保證您購買的(de)胎牛血清(qing)批次(ci)可以(yi)(yi)(yi)維持(chi)S f9細胞(bao)的(de)生長(chang)(chang)。收到產(chan)品后，您需(xu)要做的(de)就是混勻(yun)血清(qing)，在56℃下(xia)熱滅活30分(fen)鐘。這種分(fen)析(xi)(xi)法(fa)也可以(yi)(yi)(yi)用(yong)于(yu)乳白蛋白水解產(chan)品、酵母和(he)其它生長(chang)(chang)輔料作為原料的(de)生物效能分(fen)析(xi)(xi)。該(gai)分(fen)析(xi)(xi)法(fa)的(de)準確性取(qu)決于(yu)是否用(yong)常規的(de)細胞(bao)培(pei)養(yang)方案(an)進行培(pei)養(yang)。用(yong)臺盼藍染色排除法(fa)測(ce)得的(de)細胞(bao)活性少不低于(yu)80%。

細胞生長分析法。

1．使用含10%檢測或(huo)參(can)照熱滅活胎牛(niu)血清(qing)的(de)已驗證的(de)Grace昆明培(pei)養(yang)基(ji)配(pei)制*檢測培(pei)養(yang)基(ji)。

2．將儲備Sf9細胞加入50毫升離(li)心管(guan)中，在50Xg下(xia)離(li)心5分鐘(zhong)。然后將每支試管(guan)的(de)(de)沉淀物重新用含10%的(de)(de)檢測或參照(zhao)熱滅(mie)活胎牛血清(qing)*培養基(ji)配(pei)制成(cheng)懸浮液(ye)。

3．反試(shi)管顛倒(dao)幾次，然后每支試(shi)管倒(dao)出1毫(hao)升樣(yang)品。用臺(tai)盼藍染色排除進行活細(xi)胞計數。

4．如果活性≥80%，把(ba)試管再顛倒幾次并取出(chu)0.25毫升樣(yang)品(pin)。然后用Coulter計數(shu)器進行細胞計數(shu)。

5．將細(xi)胞加入Erlenmeyer瓶(ping)中，使其終(zhong)細(xi)胞濃度為2.75X10 5 cells/ml。孵(fu)育后，再一(yi)次進行細(xi)胞計數(shu)，以(yi)保證細(xi)胞密度為2.5X10 5 3.0X10 5 cells/ml。

6．將培(pei)養瓶放到搖床上，在27℃±1℃、80-90rpm條件(jian)下孵育96小(xiao)時。

7．從每一(yi)(yi)培養瓶中(zhong)分別取(qu)出0.25毫升(sheng)樣(yang)(yang)品(pin)，用Coulter計數(shu)器進行計數(shu)。同時取(qu)出一(yi)(yi)定量(liang)的(de)樣(yang)(yang)品(pin)進行細胞活性檢測。

8．將檢(jian)測細胞密度(du)與參照細胞密度(du)相(xiang)比即可(ke)得到相(xiang)對(dui)細胞密度(du)(RCN)。

噬(shi)菌(jun)體檢(jian)測:我們利用溶(rong)菌(jun)斑(ban)分(fen)析法來檢(jian)測是否存(cun)在噬(shi)菌(jun)體。從(cong)每一批(pi)血清中取具代表性的樣品加(jia)入胰蛋白酶(mei)(mei)磷酸瓊脂中，并(bing)在其加(jia)入含有噬(shi)菌(jun)體敏感的大腸桿(gan)菌(jun)懸浮液(C-3000或K-12)。然后，混合物會在胰蛋白酶(mei)(mei)磷酸瓊脂平(ping)板上分(fen)層，在36±2℃環境(jing)下(xia)孵育約24小(xiao)時后，觀察平(ping)板上溶(rong)菌(jun)斑(ban)的形態。

生化特征檢測。

血紅(hong)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)檢(jian)測：所(suo)有批次的(de)(de)胎(tai)牛血清(qing)我們都進行了血紅(hong)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)的(de)(de)檢(jian)測，血紅(hong)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)含量(liang)低于《中(zhong)國(guo)生物制品(pin)主(zhu)要原(yuan)輔材料指(zhi)控指(zhi)標(biao)》(2000年版)公布的(de)(de)指(zhi)標(biao)。

效能檢測：其它血清

新生(sheng)牛(niu)血清。檢測新生(sheng)牛(niu)血清維持超過(guo)三代(dai)VERO細(xi)胞(bao)生(sheng)長(chang)的能力。在(zai)每一個(ge)培養(yang)期，細(xi)胞(bao)都從(cong)初始孵育密度開始傳代(dai)培養(yang)。可將所得結(jie)果與(yu)使用含有已(yi)知特(te)征(zheng)的參照血清對照生(sheng)長(chang)培養(yang)基(ji)獲得的平行(xing)結(jie)果進行(xing)比較。

特級馬血清 索萊寶。每一(yi)批馬血清(qing)(qing)被檢(jian)測維(wei)持在含有(you)(you)檢(jian)測批血清(qing)(qing)的對(dui)照(zhao)培養(yang)基(ji)上Sp2/0-Ag14(小鼠骨髓瘤)細胞生(sheng)(sheng)長的能力。可將(jiang)所得結果與使(shi)用含有(you)(you)已(yi)知特征的參照(zhao)血清(qing)(qing)對(dui)照(zhao)生(sheng)(sheng)長培養(yang)基(ji)獲得的平行(xing)結果進(jin)行(xing)比較。

血(xue)清(qing)的使用與(yu)儲存：正(zheng)確的使用及保存血(xue)清(qing)，才(cai)能使血(xue)清(qing)發揮應有的作用。

1. 儲(chu)存(cun)條件(jian)：血(xue)清(qing)(qing)一般儲(chu)存(cun)于－20℃，同時應避(bi)免反復凍融。購(gou)買(mai)大包裝的血(xue)清(qing)(qing)后，先要滅活處理，然后分裝成小包裝，儲(chu)存(cun)于－20℃，使(shi)用前融化。融化時好先置于4℃。融化后的血(xue)清(qing)(qing)在4℃不宜(yi)長時間存(cun)放，應盡快使(shi)用。

2. 使(shi)用(yong)(yong)濃度：自(zi)從有(you)了合(he)成培(pei)養基(ji)，血(xue)清就是作(zuo)為(wei)一種(zhong)添加成分與合(he)成培(pei)養基(ji)混合(he)使(shi)用(yong)(yong)，使(shi)用(yong)(yong)濃度一般(ban)為(wei)5－20％，常用(yong)(yong)是10％。過多血(xue)清容(rong)(rong)易(yi)(yi)使(shi)培(pei)養中的細胞(bao)發生變化(hua)，特別(bie)是一些(xie)二倍(bei)體的無(wu)限細胞(bao)系，迅(xun)速(su)生長之后(hou)容(rong)(rong)易(yi)(yi)發生惡性轉化(hua)。

關于血清使用中的常見問題

1.保存血清好的辦法？
我(wo)們(men)建議血清(qing)應保存(cun)在-5℃-20℃。若你一次無法用完(wan)一瓶(ping)，建議您無菌(jun)分裝(zhuang)血清(qing)恰當的滅菌(jun)容器內，再放(fang)回冷凍(dong)。

2.如何解凍血清才不會使產品質量受損？
我們建議您(nin)將血清從冷凍箱中取出后(hou)，先(xian)置于(yu)2-8℃冰(bing)箱中使(shi)之(zhi)溶解(jie)，然后(hou)在室溫下使(shi)之(zhi)全溶。但必須(xu)注意(yi)的是，溶解(jie)過程中必須(xu)規則地搖晃均(jun)勻。

3.血清解凍后發現有絮狀沉淀物出現，該如何處理？
血清中沉淀物的出現有許多原因，但普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性造成的；而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解凍后，也會存在于血清中，亦是造成血清沉淀物的主要原因之一。但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質量。
若您欲去除這些絮狀沉(chen)淀物(wu)，可(ke)以將血清(qing)分裝(zhuang)無菌離心(xin)管中，以400g稍微離心(xin)，上(shang)清(qing)液即可(ke)接著加入培養基內(nei)一起過(guo)濾(lv)。我們不建議您以過(guo)濾(lv)的(de)方法(fa)去除這些絮狀沉(chen)淀物(wu)，因為它可(ke)能會阻塞您的(de)過(guo)濾(lv)膜。

4.何謂熱滅活？有必要做熱滅活嗎？
一般以56℃，30分鐘水浴來處理已解凍的血清，因為此加熱步驟，可以使補體去活性，而補體所參與的反應有：溶細胞活性，平滑肌的收縮，肥大細胞和血小板組胺的釋放，增強吞噬作用，淋巴細胞、巨噬細胞的趨化和激活。實驗顯示，經過正確處理的熱滅活血清，對大多數的細胞而言是不需要的。經過處理的血清對細胞生長只有微小的促進，或*沒有任何作用，甚通常因為高溫處理影響了血清的質量，而造成細胞生長速率的降低。
而經過熱(re)處理(li)的(de)血清，沉(chen)淀(dian)物(wu)的(de)形成會(hui)顯(xian)著的(de)增多，這些沉(chen)淀(dian)物(wu)在倒(dao)置顯(xian)微鏡下觀察，像是“小黑點”，常(chang)常(chang)會(hui)讓研究(jiu)者(zhe)誤以(yi)(yi)為是血清遭受污染，而把血清放在37℃環(huan)境中，又會(hui)使此(ci)沉(chen)淀(dian)物(wu)更增多，使研究(jiu)者(zhe)認為是微生物(wu)的(de)分(fen)裂擴(kuo)增。因(yin)此(ci)我們建議您(nin)，若非必須，您(nin)可(ke)以(yi)(yi)不需(xu)要(yao)做熱(re)滅活這一(yi)步。如(ru)此(ci)以(yi)(yi)來，不但節省您(nin)寶貴的(de)時間，更確保您(nin)的(de)質量！

5.如何避免沉淀物的出現？
我們(men)建(jian)議(yi)您在使用血(xue)清(qing)的時候(hou)，注意(yi)正(zheng)確的血(xue)清(qing)解凍(dong)步驟，并(bing)盡量避免滅(mie)活血(xue)清(qing)及長時間(jian)的將血(xue)清(qing)置于高溫(wen)環境中。

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參考文獻：
《Effect of Hypoxia on the Muscle Fiber Switching Signal Pathways CnA/NFATc1 and Myostatin in Mouse Myocytes》 作者:Lixin Li,Juan Wang,Yun Bai,Jingwei Li,Xiuju Yu,Xiaomao Luo,Zhiwei Zhu,Xiaoyan He,Yanjun Dong,Hongquan Li,Haidong Wang 期刊:Acta Histochemica 影響因子:4.239 PMID:31047685
《Generation of bioartificial hearts using decellularized scaffolds and mixed cells》 作者:Cailing Tong, Cheng Li, Baiyi Xie, Minghui Li, Xianguo Li, Zhongquan  author and Junjie Xia 期(qi)刊:BioMedical Engineering OnLine 影響(xiang)因子(zi):2.013 PMID:31164131