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優級胎牛血(xue)清

血(xue)清(qing)通常作為補充成分(fen)(fen)添(tian)加在基礎培養(yang)(yang)基內使用。它(ta)能(neng)夠提供各種大分(fen)(fen)子(zi)(zi)蛋(dan)白，小(xiao)分(fen)(fen)子(zi)(zi)量營養(yang)(yang)，水溶性成分(fen)(fen)的(de)轉運蛋(dan)白，和(he)其它(ta)一些細(xi)胞在體(ti)外所必需的(de)成分(fen)(fen)，如激素和(he)附著因子(zi)(zi)。血(xue)清(qing)可以(yi)結合或中(zhong)和(he)一些生(sheng)長因子(zi)(zi)中(zhong)的(de)有毒成分(fen)(fen)，并提供培養(yang)(yang)基的(de)緩沖能(neng)力。細(xi)胞培養(yang)(yang)時(shi)血(xue)清(qing)的(de)添(tian)加依(yi)賴(lai)于基礎培養(yang)(yang)基的(de)化學組成，培養(yang)(yang)細(xi)胞的(de)類型，及所用的(de)培養(yang)(yang)系統。

我們在(zai)提供細胞培(pei)養基、平衡鹽溶液、無血清(qing)培(pei)養基和試劑的(de)同(tong)時，還提供高品(pin)(pin)質的(de)血清(qing)。我們對血清(qing)制備進行全過程(cheng)監管(guan)。從血清(qing)收集到(dao)終產(chan)品(pin)(pin)檢驗和內部稽核的(de)每(mei)一個步驟(zou)，我們都采用設(she)備和標(biao)準操(cao)作程(cheng)序，以(yi)確(que)保整(zheng)個過程(cheng)中每(mei)個環節的(de)產(chan)品(pin)(pin)質量。對整(zheng)個過程(cheng)的(de)控(kong)制可以(yi)保證產(chan)品(pin)(pin)的(de)持續高品(pin)(pin)質，降低不同(tong)批(pi)次(ci)的(de)差異。

處(chu)(chu)理(li)(li)：全部(bu)血(xue)(xue)清：收集的(de)血(xue)(xue)液均在冷藏條(tiao)件下處(chu)(chu)理(li)(li)。血(xue)(xue)清和(he)血(xue)(xue)塊(kuai)分離后立即將(jiang)血(xue)(xue)清合并并冷凍(dong)。只有符(fu)合我們(men)的(de)檢(jian)測標(biao)準的(de)血(xue)(xue)清才被接(jie)受作進一步處(chu)(chu)理(li)(li)。

熱(re)滅活血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)(qing)：熱(re)滅活是在(zai)(zai)56℃水浴(yu)中(zhong)嚴格控溫30分(fen)鐘。透(tou)(tou)(tou)析血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)(qing)：用(yong)10,000截留分(fen)子(zi)量(liang)(liang)的(de)(de)(de)透(tou)(tou)(tou)析膜(mo)在(zai)(zai)0.15M的(de)(de)(de)NaCl中(zhong)進行透(tou)(tou)(tou)析，直到葡(pu)萄糖(tang)水平低(di)于5mg/dl(用(yong)鄰甲苯胺測試法檢驗(yan))。γ射(she)(she)線照(zhao)射(she)(she)血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)(qing)：可按(an)客戶要求對血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)(qing)進行γ射(she)(she)線照(zhao)射(she)(she)。通(tong)(tong)過γ射(she)(she)線照(zhao)射(she)(she)以滅活各種動物血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)(qing)(包(bao)括(kuo)胎(tai)牛血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)(qing)、新(xin)生牛血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)(qing)、豬血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)(qing)和馬(ma)血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)(qing))中(zhong)的(de)(de)(de)病毒(du)和支原體的(de)(de)(de)方法已經得(de)到證實(shi)。研究證實(shi)照(zhao)射(she)(she)劑量(liang)(liang)在(zai)(zai)30-45kGy為宜。血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)(qing)在(zai)(zai)此(ci)照(zhao)射(she)(she)后物理化學特(te)性和細胞培養表現沒有變(bian)化。裝(zhuang)瓶(ping)：粗血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)(qing)須通(tong)(tong)過一(yi)系列的(de)(de)(de)過濾才(cai)成為成品(pin)。后的(de)(de)(de)過濾步驟包(bao)括(kuo)使用(yong)0.2um和0.1um的(de)(de)(de)無菌(jun)過濾。胎(tai)牛血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)(qing)須通(tong)(tong)過三(san)次0.1um過濾，其他血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)(qing)須通(tong)(tong)過0.2um過濾。終產(chan)(chan)品(pin)的(de)(de)(de)質量(liang)(liang)控制(zhi)：我們采取(qu)(qu)以下方法對每一(yi)批(pi)次的(de)(de)(de)產(chan)(chan)品(pin)選取(qu)(qu)一(yi)定數量(liang)(liang)的(de)(de)(de)樣品(pin)進行質量(liang)(liang)控制(zhi)分(fen)析：

化學檢測：使(shi)用低溫(wen)凝固點(dian)的(de)方(fang)法檢測滲透(tou)壓(ya)，以保(bao)證符合產品規(gui)范。我(wo)們(men)每天(tian)使(shi)用國家(jia)標(biao)準的(de)技(ji)(ji)術研究所(suo)(suo)標(biao)定的(de)標(biao)準溶(rong)液對(dui)我(wo)們(men)的(de)滲透(tou)壓(ya)檢測儀器進(jin)(jin)行(xing)校(xiao)準。同樣每天(tian)使(shi)用國家(jia)標(biao)準技(ji)(ji)術研究所(suo)(suo)標(biao)定的(de)標(biao)準溶(rong)液對(dui)pH計進(jin)(jin)行(xing)校(xiao)準。

使用電(dian)泳圖譜鑒定血(xue)清的(de)(de)整體(ti)性質。樣品被轉移(yi)到硝酸纖維素基質中，并在緩沖體(ti)系內遷(qian)移(yi)。條(tiao)帶經染色、清潔(jie)、干燥后(hou)用密度(du)儀進行掃描，以檢測白蛋(dan)白和球蛋(dan)白組分(fen)的(de)(de)相對(dui)濃度(du)。為證實是(shi)否在適(shi)當(dang)的(de)(de)條(tiao)件下進行采血(xue)和處理，使用修飾的(de)(de)Fleming方法對(dui)血(xue)紅蛋(dan)白進行分(fen)光光度(du)檢測。

隨著動(dong)物(wu)年齡(ling)的(de)增加，血(xue)清總蛋白(bai)含量(liang)也相應地提(ti)高(gao)。使用(yong)自(zi)動(dong)化的(de)Biuret方法(fa)進行總血(xue)清蛋白(bai)的(de)檢(jian)測，以確認動(dong)物(wu)年齡(ling)并(bing)驗證符(fu)合(he)產品(pin)規(gui)范。使用(yong)色度(du)計在不同波(bo)長(chang)下檢(jian)測樣品(pin)和(he)Biuret試劑混合(he)波(bo)的(de)吸光度(du)。自(zi)動(dong)計算(suan)結(jie)果后，與(yu)標準曲線比較，即(ji)可得到(dao)蛋白(bai)值(zhi)(克/公升)。

穩定(ding)(ding)性(xing)檢測程序(xu)：在每一(yi)個標記(ji)為體(ti)外(wai)診斷的(de)(de)產(chan)品(pin)上顯示(shi)的(de)(de)效(xiao)期表明(ming)了(le)(le)這個產(chan)品(pin)具有(you)多長時間的(de)(de)效(xiao)能。我們(men)的(de)(de)穩定(ding)(ding)性(xing)程序(xu)確(que)定(ding)(ding)和證明(ming)了(le)(le)產(chan)品(pin)效(xiao)期。我們(men)定(ding)(ding)期監測批量產(chan)品(pin)，確(que)定(ding)(ding)產(chan)品(pin)在推薦貯存條件下具有(you)可接受效(xiao)果的(de)(de)時間長度(du)。

微(wei)生物(wu)(wu)學檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)：所有(you)血(xue)清使(shi)(shi)用Barile&Kern的(de)(de)大體積方(fang)法檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)支原(yuan)體。在(zai)推薦(jian)方(fang)法的(de)(de)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)范(fan)圍(wei)內檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)結果(guo)是準確(que)的(de)(de)。樣(yang)品少(shao)(shao)應該在(zai)肉湯中(zhong)合并培養3個星期，同時要在(zai)瓊脂(zhi)平(ping)板(ban)(ban)上進行(xing)不少(shao)(shao)于4次(ci)傳代培養。在(zai)有(you)氧(yang)和厭氧(yang)(95%氮，5%CO2)條件下，平(ping)板(ban)(ban)在(zai)36±2℃下孵(fu)育。在(zai)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)過程中(zhong)，每周(zhou)對(dui)瓊脂(zhi)平(ping)板(ban)(ban)進行(xing)一次(ci)微(wei)生物(wu)(wu)生長(chang)情(qing)況檢(jian)(jian)(jian)驗(yan)。使(shi)(shi)用Dienes染色法對(dui)懷疑被污(wu)染的(de)(de)瓊脂(zhi)平(ping)板(ban)(ban)進行(xing)支原(yuan)體菌落的(de)(de)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)。然(ran)后(hou)，對(dui)平(ping)板(ban)(ban)進行(xing)再次(ci)鏡(jing)檢(jian)(jian)(jian)。對(dui)孵(fu)育肉湯瓶要定期進行(xing)濁度(du)和pH值變動的(de)(de)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)。在(zai)推薦(jian)方(fang)法檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)范(fan)圍(wei)內，所有(you)血(xue)清也要使(shi)(shi)用Hoechst熒光DNA染色法進行(xing)不可在(zai)肉湯中(zhong)培養的(de)(de)支原(yuan)體(包括M.hyorhinis屬)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)。

病(bing)(bing)毒(du)檢(jian)測：已(yi)知(zhi)無外來物質的(de)細(xi)胞培養基(ji)須經過在包含15%測試血(xue)清(qing)的(de)生長培養基(ji)中(zhong)進行(xing)為期21天的(de)三次(ci)傳代培養。使用(yong)對照培養基(ji)和(he)已(yi)知(zhi)對外來物質為陰(yin)性(xing)的(de)血(xue)清(qing)平行(xing)地維持陰(yin)性(xing)對照培養。整個期間，檢(jian)測所有(you)的(de)培養情況(kuang)，以便發現是否存在病(bing)(bing)毒(du)誘(you)發的(de)細(xi)胞形(xing)態(tai)改變(bian)或致細(xi)胞病(bing)(bing)變(bian)效(xiao)應。在1421天的(de)培養期間，對含有(you)檢(jian)測血(xue)清(qing)的(de)平行(xing)培養瓶按(an)下面標準(zhun)病(bing)(bing)毒(du)檢(jian)測方法進行(xing)評估。

將其中(zhong)一瓶檢(jian)(jian)測(ce)細胞(bao)用(yong)胰蛋(dan)白酶(mei)消化，然后把細胞(bao)分別加入(ru)(ru)到總面積為(wei)6cm 2 的(de)六(liu)室載玻(bo)片上(shang)。同(tong)時準備陰性(xing)對照載玻(bo)片。在(zai)檢(jian)(jian)測(ce)培養的(de)單室載玻(bo)片上(shang)加入(ru)(ru)牛病(bing)(bing)毒性(xing)腹(fu)瀉病(bing)(bing)毒(BVDV)、牛細小(xiao)病(bing)(bing)毒、牛腺病(bing)(bing)毒、狂(kuang)犬病(bing)(bing)毒和呼腸病(bing)(bing)毒的(de)染色劑，作(zuo)為(wei)單個的(de)陽性(xing)對照。再經過7天培養(總共(gong)21天)，利用(yong)熒光抗體技術檢(jian)(jian)測(ce)病(bing)(bing)毒。

通過對檢(jian)測培(pei)養進行蘇木精伊紅染(ran)色(se)，觀察致(zhi)細胞突變效應(ying)(CPE)或其他病(bing)毒誘導(dao)效應(ying)。檢(jian)測細胞是否存在CPE效應(ying)、內含物、多核(he)體或其他異常(chang)效應(ying)。

內(nei)毒(du)素檢(jian)測(ce)：我(wo)們用(yong)阿米(mi)巴(ba)變形細胞溶(rong)解(jie)物(wu)(LAL)凝膠法(fa)來檢(jian)測(ce)胎牛血清的內(nei)毒(du)素含量。

效能檢測：
對每一批次的(de)(de)胎牛血(xue)清，我(wo)(wo)們都進行下述(shu)培養(yang)(yang)效能(neng)檢測。選擇血(xue)清重要的(de)(de)標準是(shi)其支持特殊細胞的(de)(de)生長(chang)能(neng)力。因(yin)此，除了保(bao)證血(xue)清通過嚴格的(de)(de)品質(zhi)控(kong)制，我(wo)(wo)們也同時(shi)在實驗(yan)室條件下對血(xue)清的(de)(de)三個重要的(de)(de)培養(yang)(yang)效能(neng)進行檢測：克隆(long)效率、貼壁效果和二倍體成纖維細胞生長(chang)促進。

克隆效率分析：克隆效率實驗分析每一批胎牛血清促進小鼠骨髓瘤細胞及其衍生的雜交瘤細胞的克隆和生長能力。下列產品
經驗證可用于該實驗：
Sp2/0-Ag14(ATCC #CRL 1581)
P3x63-Ag8.653(ATCC #CRL 1580)

每一(yi)批(pi)胎牛(niu)血(xue)(xue)清都(dou)要分(fen)別在復制(zhi)微量滴定平(ping)板上加入兩種血(xue)(xue)清濃(nong)(nong)度和(he)(he)兩種細(xi)胞接(jie)種量(10%血(xue)(xue)清和(he)(he)1cell/孔(kong)，4%血(xue)(xue)清和(he)(he)5cells/孔(kong))的(de)(de)情(qing)況下進行分(fen)析。克隆分(fen)析結果(guo)除以(yi)已(yi)確定的(de)(de)參照血(xue)(xue)清值得以(yi)歸一(yi)化(hua)。在許(xu)多日常雜(za)交選擇程序中具有(you)代表性的(de)(de)是(shi)高濃(nong)(nong)度的(de)(de)血(xue)(xue)清，而低(di)濃(nong)(nong)度血(xue)(xue)清在設計血(xue)(xue)清批(pi)次細(xi)微差異放大檢測(ce)中有(you)更(geng)為嚴格的(de)(de)測(ce)試(shi)(shi)。嚴格的(de)(de)1cell/孔(kong)測(ce)試(shi)(shi)是(shi)模擬單一(yi)雜(za)交選擇的(de)(de)實(shi)驗室條件。為每一(yi)批(pi)次胎牛(niu)血(xue)(xue)清提(ti)供(gong)的(de)(de)分(fen)析證明報告(gao)中的(de)(de)克隆效率值為兩次測(ce)試(shi)(shi)條件下的(de)(de)平(ping)均值。

克隆分析法：克隆分析法是在復式96孔板中加入兩種胎牛血清濃度(10%v/v)和(4%v/v)和兩種接種量的情況下進行的。每一次化驗中，同時測量前期已驗證合格的一批胎牛血清，并將此測量值作為內部參考標準。
克隆分析按下述方法(fa)進行：

1．Sp2/0-Ag14(sp2)和P3x63-Ag8.653(653)在(zai)含(han)有(you)10%的胎牛血清的RPM1640中通常保持對數生長期(qi)。在(zai)顯微鏡下，利用臺盼(pan)藍排除法對活(huo)細胞進行計數。

2．用RPM1640培養基(ji)將儲備細胞懸(xuan)浮液進行(xing)連續(xu)稀釋，使(shi)其(qi)達到預期(qi)的(de)25cells/ml和(he)5cells/ml接種(zhong)濃度。準備含有參照或(huo)測試胎牛血(xue)清的(de)RPM1640培養基(ji)。將這(zhe)種(zhong)密度的(de)細胞分配到各個(ge)分析生長培養基(ji)體(ti)積為0.2毫(hao)升的(de)孔中，使(shi)其(qi)分別(bie)平均含有5個(ge)和(he)1個(ge)細胞。

3．將96孔板放入36±2℃，4-6% CO 2 的潮濕培養箱孵育約(yue)1015天。

4．在孵(fu)育期(qi)間，用(yong)肉眼觀察平板(ban)并(bing)對用(yong)于(yu)克隆(long)(long)的孔進行計(ji)數。克隆(long)(long)效率按下列(lie)方法(fa)計(ji)算：克隆(long)(long)效率=(陽性孔平均數/孵(fu)育孔總數)×100%

5．每(mei)一(yi)批次胎牛血(xue)(xue)(xue)清(qing)維持指示劑(ji)骨(gu)髓瘤(liu)細(xi)胞(bao)克隆(long)效率的(de)定量按照以下方法(fa)測得的(de)相對(dui)克隆(long)效率(RCE)進(jin)行歸一(yi)化：RCE=檢(jian)測血(xue)(xue)(xue)清(qing)的(de)克隆(long)效率/對(dui)照血(xue)(xue)(xue)清(qing)的(de)克隆(long)效率貼(tie)(tie)壁(bi)(bi)效率分析：貼(tie)(tie)壁(bi)(bi)效率分析是利用(yong)已(yi)轉型的(de)人類細(xi)胞(bao)系(xi)來檢(jian)測每(mei)一(yi)批血(xue)(xue)(xue)清(qing)促使持續貼(tie)(tie)附細(xi)胞(bao)系(xi)的(de)生長能力(li)。選(xuan)擇(ze)已(yi)被驗證可(ke)以檢(jian)測貼(tie)(tie)壁(bi)(bi)效率的(de)細(xi)胞(bao)系(xi)A549(人肺腫瘤(liu)細(xi)胞(bao)，ATCC#CCL,185)，是因為它可(ke)以區分一(yi)批血(xue)(xue)(xue)清(qing)維持細(xi)胞(bao)貼(tie)(tie)壁(bi)(bi)和繁殖(zhi)能力(li)的(de)細(xi)微差異。

每一(yi)批次(ci)(ci)胎(tai)牛(niu)血(xue)(xue)清(qing)(qing)都要在兩(liang)(liang)種(zhong)(zhong)血(xue)(xue)清(qing)(qing)濃(nong)度(du)和兩(liang)(liang)種(zhong)(zhong)細胞接種(zhong)(zhong)濃(nong)度(du)下(xia)(10%血(xue)(xue)清(qing)(qing)和100cells/孔，4%血(xue)(xue)清(qing)(qing)和200cells/孔)測(ce)試(shi)三次(ci)(ci)。在36±2℃，4-6% CO 2 的潮濕(shi)培養(yang)箱孵育約1014天，對(dui)被染色(se)的細胞菌(jun)落進行計數即可(ke)得(de)到其貼壁效率。將結果除以(yi)參考(kao)的對(dui)照血(xue)(xue)清(qing)(qing)得(de)以(yi)歸一(yi)化。通過兩(liang)(liang)種(zhong)(zhong)血(xue)(xue)清(qing)(qing)濃(nong)度(du)的測(ce)試(shi)，可(ke)以(yi)驗(yan)證該批次(ci)(ci)血(xue)(xue)清(qing)(qing)在減量和標準(zhun)水平下(xia)維(wei)持生長的能力。為(wei)每一(yi)批次(ci)(ci)胎(tai)牛(niu)血(xue)(xue)清(qing)(qing)提供的分析證明報告中(zhong)的貼壁效率值為(wei)兩(liang)(liang)次(ci)(ci)測(ce)試(shi)條件下(xia)的平均值。

貼壁分(fen)析法：使(shi)用(yong)貼附分(fen)析檢(jian)測(ce)上述每(mei)一批測(ce)試血(xue)清。這種分(fen)析法針對(dui)每(mei)一個血(xue)清樣品使(shi)用(yong)一個6孔(kong)板(每(mei)室(shi)9.6cm 2 )，并(bing)可(ke)以對(dui)三(san)個孔(kong)的(de)數據進行(xing)平均處(chu)理。每(mei)一次化驗中，同時(shi)測(ce)量前期已驗證合格的(de)一批胎牛(niu)血(xue)清，并(bing)將此測(ce)量值作為內部參考標準。

貼附分析按下述方(fang)法進行：

1．A549細胞系用含有10%胎牛(niu)血清的DMEM培養基，在36±2℃，以亞融合密(mi)度下進行培養。

2．含10%(v/v)和4%(v/v)血清的DMEM由分別在22.5毫(hao)升(sheng)(sheng)(sheng)和24毫(hao)升(sheng)(sheng)(sheng)DMEM中加(jia)(jia)入(ru)2.5毫(hao)升(sheng)(sheng)(sheng)和1毫(hao)升(sheng)(sheng)(sheng)胎牛血清配制而成，終有效體積為25毫(hao)升(sheng)(sheng)(sheng)。將(jiang)5毫(hao)升(sheng)(sheng)(sheng)含血清培(pei)養基分別加(jia)(jia)入(ru)6孔板的每(mei)一個(ge)孔中。

3．A549培(pei)養(yang)細胞先經過胰蛋白酶(mei)消化，測定活細胞數，然后稀(xi)釋細胞懸(xuan)浮(fu)液2,000cells/ml。

4．將0.1毫升細(xi)胞懸浮(fu)液加(jia)入200cells/孔室中(zhong)，0.05毫升懸浮(fu)液加(jia)入100cells/孔室中(zhong)。平板混合(he)后放入36±2℃，5%CO 2 的潮濕培養(yang)箱(xiang)孵育約1014天。

5．孵(fu)育后，取出(chu)平板(ban)，去(qu)除(chu)生(sheng)長(chang)培養基(ji)，用(yong)亞甲基(ji)蘭-甲醇溶液(ye)對菌落(luo)進行(xing)染色。

6．計算菌落(luo)形成，然后按下述方(fang)法計算貼壁效(xiao)率：%貼壁效(xiao)率=每(mei)孔菌落(luo)平(ping)均數/每(mei)孔孵育(yu)活細胞平(ping)均數×100

7．為方便比較(jiao)，將(jiang)測(ce)得的(de)貼(tie)壁(bi)效率(lv)數值除以每批檢測(ce)血清(qing)的(de)相對(dui)貼(tie)壁(bi)效率(lv)(RPE)得以歸一化：RCE=檢測(ce)血清(qing)的(de)貼(tie)壁(bi)效率(lv)/參照血清(qing)的(de)貼(tie)壁(bi)效率(lv)二倍體成(cheng)纖維(wei)(wei)細(xi)胞(bao)生長(chang)：促進生長(chang)分析(xi)用于(yu)檢測(ce)每一批胎牛血清(qing)維(wei)(wei)持難培養的(de)人二倍體成(cheng)纖維(wei)(wei)細(xi)胞(bao)長(chang)期生長(chang)的(de)能力。

下列細胞系經認證可用(yong)于該實驗：

WI-38(人(ren)二倍體肺(fei)成纖維細胞，ATCC#CCL 75)

WI-38細(xi)(xi)胞在含5%胎牛血清的低(di)密(mi)度(du)(2X10 5 /瓶)復(fu)式25-cm 2瓶中孵育(yu)，并進行為(wei)期三(san)個連續7天的傳代(dai)培(pei)(pei)養。在每(mei)一個培(pei)(pei)養期，細(xi)(xi)胞都從初始(shi)孵育(yu)密(mi)度(du)開始(shi)傳代(dai)培(pei)(pei)養。壓(ya)力(li)(li)分層率、成倍(bei)繁殖(zhi)數量(liang)和減(jian)量(liang)血清濃度(du)是每(mei)批(pi)次(ci)(ci)促(cu)(cu)進難(nan)培(pei)(pei)養二倍(bei)體(ti)細(xi)(xi)胞的生(sheng)長(chang)血清的嚴格測(ce)試指標。通過連續三(san)代(dai)培(pei)(pei)養以(yi)減(jian)少前一次(ci)(ci)生(sheng)長(chang)培(pei)(pei)養基的殘留(liu)影響，從而保證(zheng)得到檢(jian)測(ce)批(pi)促(cu)(cu)進生(sheng)長(chang)能(neng)力(li)(li)的真(zhen)實(shi)結果(guo)。為(wei)每(mei)一批(pi)次(ci)(ci)胎牛血清提供(gong)的分析證(zheng)明報(bao)告為(wei)第(di)三(san)次(ci)(ci)傳代(dai)培(pei)(pei)養每(mei)復(fu)式培(pei)(pei)養瓶細(xi)(xi)胞數的平均(jun)值。將檢(jian)測(ce)值除(chu)以(yi)參考(kao)對照值得以(yi)歸一化。

二倍體成(cheng)(cheng)纖維細胞(bao)(bao)生(sheng)長(chang)分析(xi)法：培養數(shu)代(dai)WI-38人類二倍體肺成(cheng)(cheng)纖維細胞(bao)(bao)，計(ji)算每一代(dai)的(de)細胞(bao)(bao)總數(shu)。此項檢測所(suo)挑選出(chu)的(de)胎牛血清批號(hao)能維持難以生(sheng)長(chang)細胞(bao)(bao)、貼壁性細胞(bao)(bao)、正常(chang)的(de)細胞(bao)(bao)株生(sheng)長(chang)及存活(huo)。

1．準備(bei)含(han)5%檢測血清或(huo)已(yi)驗證合格的參照血清生長培養基(ji)，基(ji)礎生長培養基(ji)為含(han)L-谷氨酰胺的HBME：EBME(1：1)。按要求，在每一次流(liu)量變化和分析過程(cheng)中進行傳代培養時需配制(zhi)含(han)5%血清生長的培養基(ji)。

2．在(zai)(zai)低代培養水平時，將(jiang)2X10 5 WI-38細胞加入各個含9.5毫(hao)升(sheng)生長培養基的復式25-cm 2 培養基中。在(zai)(zai)不擰緊瓶(ping)蓋(gai)的情(qing)況下(xia)，將(jiang)培養瓶(ping)放(fang)入4-6%CO 2， 36℃±2℃環境中，保持24小時。然后擰緊瓶(ping)蓋(gai)，將(jiang)培養瓶(ping)放(fang)在(zai)(zai)36℃±2℃下(xia)孵(fu)育7天(tian)，在(zai)(zai)第(di)2天(tian)或第(di)3天(tian)全部(bu)更換培養基。

3．在(zai)第7天，用胰蛋白(bai)酶對每一個含(han)參照(zhao)或(huo)檢測血清的復式(shi)瓶中的細胞進(jin)(jin)行(xing)(xing)消化得到(dao)一定(ding)數(shu)量(liang)細胞，然后合并并計(ji)數(shu)。將2x10 5 WI-38細胞加入含(han)有新(xin)鮮生長培(pei)養基(已加入了與上一代同一批次(ci)的參照(zhao)或(huo)檢測胎(tai)牛(niu)血清)的新(xin)的復式(shi)25-cm 2 瓶中，進(jin)(jin)行(xing)(xing)細胞傳(chuan)代培(pei)養。按第2步所述，將培(pei)養瓶進(jin)(jin)行(xing)(xing)平(ping)衡并孵育(yu)。

4．如上所述經(jing)過三代連續分析，在每(mei)(mei)一(yi)(yi)代結束時(shi)計算每(mei)(mei)一(yi)(yi)批參照(zhao)(zhao)或檢測血清的每(mei)(mei)瓶細胞平(ping)均數。后一(yi)(yi)代培養(yang)的各(ge)批檢測血清實驗中的相對(dui)生(sheng)長率(lv)(RGR)作為(wei)參照(zhao)(zhao)血清實驗中獲得的細胞生(sheng)長率(lv)分子：

%RGR=檢(jian)測血清(qing)實(shi)驗(yan)中(zhong)每瓶平均(jun)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)數(shu)/參(can)照(zhao)血清(qing)實(shi)驗(yan)中(zhong)每瓶平均(jun)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)數(shu)X100S f9細(xi)胞(bao)(bao)(bao)生(sheng)(sheng)長(chang)促進分(fen)析(xi)。通過昆蟲分(fen)析(xi)可(ke)以(yi)保證(zheng)您購買的(de)胎牛血清(qing)批次可(ke)以(yi)維持(chi)S f9細(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)生(sheng)(sheng)長(chang)。收到產品(pin)后，您需要做(zuo)的(de)就是(shi)混勻血清(qing)，在56℃下熱滅(mie)活30分(fen)鐘。這種分(fen)析(xi)法(fa)也可(ke)以(yi)用(yong)(yong)于乳(ru)白(bai)蛋白(bai)水解產品(pin)、酵母和其(qi)它生(sheng)(sheng)長(chang)輔料(liao)作為原料(liao)的(de)生(sheng)(sheng)物(wu)效能(neng)分(fen)析(xi)。該分(fen)析(xi)法(fa)的(de)準(zhun)確性(xing)取決于是(shi)否用(yong)(yong)常(chang)規的(de)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)培(pei)養方案進行培(pei)養。用(yong)(yong)臺盼藍染色排除法(fa)測得的(de)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)活性(xing)少(shao)不低于80%。

細胞生長分析法。

1．使用含10%檢(jian)(jian)測或參照(zhao)熱(re)滅活胎牛血清的已驗證的Grace昆明培養(yang)基配制*檢(jian)(jian)測培養(yang)基。

2．將儲備Sf9細胞(bao)加(jia)入50毫升離心(xin)管中，在50Xg下離心(xin)5分鐘。然后(hou)將每支試管的(de)沉淀物重新用含10%的(de)檢測或參照熱(re)滅活胎牛血(xue)清(qing)*培養基配制成懸浮液。

3．反試管(guan)顛倒幾(ji)次，然(ran)后每(mei)支試管(guan)倒出(chu)1毫升(sheng)樣(yang)品。用臺(tai)盼藍染色排除進行活細(xi)胞計(ji)數(shu)。

4．如果活性≥80%，把試(shi)管(guan)再顛倒幾次并(bing)取出0.25毫升(sheng)樣品。然(ran)后用Coulter計數器進(jin)行細(xi)胞計數。

5．將細(xi)胞(bao)加入Erlenmeyer瓶中，使(shi)其(qi)終細(xi)胞(bao)濃度為2.75X10 5 cells/ml。孵育后，再一次(ci)進行(xing)細(xi)胞(bao)計數，以保證細(xi)胞(bao)密度為2.5X10 5 3.0X10 5 cells/ml。

6．將培養(yang)瓶放到搖床上(shang)，在27℃±1℃、80-90rpm條(tiao)件(jian)下孵育96小(xiao)時(shi)。

7．從每一培養瓶(ping)中分別取出0.25毫升樣(yang)品(pin)，用Coulter計數器(qi)進行計數。同時取出一定量的(de)樣(yang)品(pin)進行細(xi)胞活性檢(jian)測。

8．將檢(jian)測細(xi)胞密度(du)(du)與參(can)照細(xi)胞密度(du)(du)相比即可得(de)到相對細(xi)胞密度(du)(du)(RCN)。

噬菌(jun)體檢測:我(wo)們利用溶(rong)菌(jun)斑(ban)分析法來檢測是否存在(zai)噬菌(jun)體。從每(mei)一批(pi)血清中取具代表性的樣品加(jia)入胰(yi)蛋(dan)白酶(mei)磷酸瓊脂中，并在(zai)其加(jia)入含有噬菌(jun)體敏感的大腸桿(gan)菌(jun)懸浮液(C-3000或K-12)。然后，混合物會(hui)在(zai)胰(yi)蛋(dan)白酶(mei)磷酸瓊脂平板(ban)上分層，在(zai)36±2℃環境下孵育約24小時后，觀察平板(ban)上溶(rong)菌(jun)斑(ban)的形態。

生化特征檢測。

血(xue)紅蛋白(bai)(bai)檢測：所有批次的(de)(de)胎牛血(xue)清我(wo)們(men)都進行(xing)了血(xue)紅蛋白(bai)(bai)的(de)(de)檢測，血(xue)紅蛋白(bai)(bai)含量低于《中國生物制品(pin)主要原(yuan)輔材料(liao)指(zhi)控指(zhi)標》(2000年版)公布的(de)(de)指(zhi)標。

效能檢測：其它血清

優(you)級胎(tai)牛血清。檢測新生牛血清維持超過三代(dai)VERO細胞生長的能力。在每一個(ge)培(pei)(pei)養期(qi)，細胞都從初始孵(fu)育(yu)密度(du)開始傳(chuan)代(dai)培(pei)(pei)養。可將所得(de)結(jie)果(guo)與使(shi)用含(han)有已知特征的參照(zhao)血清對照(zhao)生長培(pei)(pei)養基獲(huo)得(de)的平行結(jie)果(guo)進(jin)行比(bi)較。

馬血清。每一批(pi)馬血清被檢測維持(chi)在含有(you)檢測批(pi)血清的(de)對(dui)照培養基上Sp2/0-Ag14(小(xiao)鼠骨(gu)髓(sui)瘤)細胞生長的(de)能力。可將所得結果與使用(yong)含有(you)已知特征的(de)參照血清對(dui)照生長培養基獲得的(de)平行(xing)(xing)結果進(jin)行(xing)(xing)比(bi)較(jiao)。

血(xue)清的使用(yong)與儲(chu)存：正確(que)的使用(yong)及保存血(xue)清，才(cai)能使血(xue)清發揮應(ying)有的作用(yong)。

1. 儲(chu)存(cun)條件：血清(qing)一般儲(chu)存(cun)于－20℃，同(tong)時(shi)應避免反復(fu)凍融(rong)。購(gou)買大(da)包裝的血清(qing)后(hou)，先要滅活處理，然后(hou)分裝成小包裝，儲(chu)存(cun)于－20℃，使用前融(rong)化(hua)(hua)。融(rong)化(hua)(hua)時(shi)好先置于4℃。融(rong)化(hua)(hua)后(hou)的血清(qing)在4℃不宜長時(shi)間存(cun)放，應盡快使用。

2. 使用(yong)濃度(du)(du)：自從有了合(he)(he)成(cheng)培養基(ji)，血清(qing)就是(shi)作為一種添(tian)加(jia)成(cheng)分與合(he)(he)成(cheng)培養基(ji)混合(he)(he)使用(yong)，使用(yong)濃度(du)(du)一般(ban)為5－20％，常(chang)用(yong)是(shi)10％。過(guo)多血清(qing)容易(yi)使培養中的(de)細胞發(fa)(fa)生變化，特別是(shi)一些二倍體的(de)無限細胞系，迅速生長之后(hou)容易(yi)發(fa)(fa)生惡性轉化。

關于使用中的常見問題

1.保存血清好的辦法？
我們建議血清應保存(cun)在-5℃-20℃。若(ruo)你一次無(wu)法用(yong)完一瓶，建議您(nin)無(wu)菌分裝血清恰當的(de)滅(mie)菌容器內，再放回冷(leng)凍。

2.如何解凍血清才不會使產品質量受損？
我(wo)們(men)建議您將血清從冷凍箱中(zhong)(zhong)取(qu)出后(hou)，先置于2-8℃冰箱中(zhong)(zhong)使之溶解(jie)，然(ran)后(hou)在室溫下使之全溶。但必須(xu)(xu)注意的是，溶解(jie)過(guo)程中(zhong)(zhong)必須(xu)(xu)規則地搖晃均勻(yun)。

3.血清解凍后發現有絮狀沉淀物出現，該如何處理？
血清中沉淀物的出現有許多原因，但普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性造成的；而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解凍后，也會存在于血清中，亦是造成血清沉淀物的主要原因之一。但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質量。
若您欲(yu)去(qu)除這些絮(xu)狀沉淀(dian)物(wu)(wu)，可(ke)以(yi)將血清(qing)分裝無菌離心管中，以(yi)400g稍微離心，上清(qing)液(ye)即可(ke)接著加入(ru)培養基內一起過(guo)濾。我們不建議您以(yi)過(guo)濾的方法去(qu)除這些絮(xu)狀沉淀(dian)物(wu)(wu)，因為它可(ke)能會阻塞(sai)您的過(guo)濾膜。

4.何謂熱滅活？有必要做熱滅活嗎？
一般以56℃，30分鐘水浴來處理已解凍的血清，因為此加熱步驟，可以使補體去活性，而補體所參與的反應有：溶細胞活性，平滑肌的收縮，肥大細胞和血小板組胺的釋放，增強吞噬作用，淋巴細胞、巨噬細胞的趨化和激活。實驗顯示，經過正確處理的熱滅活血清，對大多數的細胞而言是不需要的。經過處理的血清對細胞生長只有微小的促進，或*沒有任何作用，甚通常因為高溫處理影響了血清的質量，而造成細胞生長速率的降低。
而(er)經過熱(re)處理的血(xue)清(qing)，沉淀物(wu)的形成會顯著的增(zeng)多，這(zhe)些沉淀物(wu)在倒置顯微鏡(jing)下觀(guan)察(cha)，像(xiang)是“小黑點"，常常會讓(rang)研(yan)究者誤以(yi)為是血(xue)清(qing)遭受污染，而(er)把血(xue)清(qing)放在37℃環境中(zhong)，又會使(shi)此沉淀物(wu)更增(zeng)多，使(shi)研(yan)究者認為是微生物(wu)的分裂擴增(zeng)。因此我(wo)們(men)建(jian)議您(nin)，若非必須，您(nin)可以(yi)不需要(yao)做(zuo)熱(re)滅活這(zhe)一步(bu)。如此以(yi)來，不但節省您(nin)寶貴(gui)的時間，更確保(bao)您(nin)血(xue)清(qing)的質量！

5.如何避免沉淀物的出現？
我(wo)們(men)建議您(nin)在使用血清(qing)的時(shi)候(hou)，注意正確的血清(qing)解凍(dong)步驟，并盡量避免(mian)滅活血清(qing)及長時(shi)間的將血清(qing)置于高(gao)溫(wen)環境中。

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