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 胎牛血清通常(chang)作為補(bu)充成分(fen)(fen)添加在基(ji)(ji)礎(chu)(chu)培(pei)養基(ji)(ji)內使用(yong)。它能夠提供各種(zhong)大分(fen)(fen)子(zi)(zi)蛋白，小分(fen)(fen)子(zi)(zi)量(liang)營養，水溶性成分(fen)(fen)的(de)轉運(yun)蛋白，和(he)(he)其(qi)它一(yi)些細(xi)胞(bao)在體(ti)外所(suo)必(bi)需的(de)成分(fen)(fen)，如激素和(he)(he)附著因子(zi)(zi)。血清可以結合或中和(he)(he)一(yi)些生長因子(zi)(zi)中的(de)有毒成分(fen)(fen)，并提供培(pei)養基(ji)(ji)的(de)緩沖能力(li)。細(xi)胞(bao)培(pei)養時(shi)血清的(de)添加依賴于基(ji)(ji)礎(chu)(chu)培(pei)養基(ji)(ji)的(de)化學組成，培(pei)養細(xi)胞(bao)的(de)類型，及所(suo)用(yong)的(de)培(pei)養系統。

我們在提供細(xi)胞培養基、平衡鹽溶液(ye)、無血(xue)清(qing)(qing)培養基和試劑的(de)(de)同(tong)時，還提供高品質的(de)(de)血(xue)清(qing)(qing)。我們對血(xue)清(qing)(qing)制備(bei)進(jin)行(xing)全過程(cheng)監管。從血(xue)清(qing)(qing)收集(ji)到終產(chan)品檢驗和內部稽核(he)的(de)(de)每一個(ge)步驟，我們都采(cai)用(yong)設(she)備(bei)和標準操作程(cheng)序，以確保(bao)整個(ge)過程(cheng)中每個(ge)環節的(de)(de)產(chan)品質量。對整個(ge)過程(cheng)的(de)(de)控制可以保(bao)證產(chan)品的(de)(de)持續高品質，降低不同(tong)批次的(de)(de)差異。

處理(li)：全部血(xue)清(qing)(qing)：收集的血(xue)液均在(zai)冷藏條件下處理(li)。血(xue)清(qing)(qing)和(he)xue塊分離后立即將血(xue)清(qing)(qing)合并并冷凍。只有符合我們的檢測標準的血(xue)清(qing)(qing)才被(bei)接受作進一(yi)步處理(li)。

熱滅活(huo)血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)：熱滅活(huo)是(shi)在56℃水(shui)浴中嚴(yan)格控溫30分鐘。透(tou)析(xi)血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)：用10,000截(jie)留分子量(liang)的(de)透(tou)析(xi)膜在0.15M的(de)NaCl中進行透(tou)析(xi)，直到(dao)葡萄糖水(shui)平(ping)低于5mg/dl(用鄰甲苯胺測試法檢驗)。γ射(she)(she)線照射(she)(she)血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)：可按客戶要求對血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)進行γ射(she)(she)線照射(she)(she)。通過(guo)(guo)(guo)γ射(she)(she)線照射(she)(she)以(yi)滅活(huo)各種動物血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(包(bao)括(kuo)胎(tai)牛(niu)(niu)血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)、新生牛(niu)(niu)血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)、豬血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)和(he)馬血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing))中的(de)病(bing)毒和(he)支原體的(de)方(fang)(fang)法已經得到(dao)證實。研究證實照射(she)(she)劑(ji)量(liang)在30-45kGy為宜。血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)在此照射(she)(she)后物理化(hua)學特性(xing)和(he)細胞培(pei)養表現(xian)沒(mei)有變化(hua)。裝瓶：粗血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)須(xu)通過(guo)(guo)(guo)一系(xi)列的(de)過(guo)(guo)(guo)濾(lv)(lv)才成為成品。后的(de)過(guo)(guo)(guo)濾(lv)(lv)步驟包(bao)括(kuo)使(shi)用0.2um和(he)0.1um的(de)無菌過(guo)(guo)(guo)濾(lv)(lv)。胎(tai)牛(niu)(niu)血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)須(xu)通過(guo)(guo)(guo)三次(ci)0.1um過(guo)(guo)(guo)濾(lv)(lv)，其他血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)須(xu)通過(guo)(guo)(guo)0.2um過(guo)(guo)(guo)濾(lv)(lv)。終產品的(de)質(zhi)量(liang)控制(zhi)：我(wo)們(men)采(cai)取(qu)以(yi)下方(fang)(fang)法對每(mei)一批(pi)次(ci)的(de)產品選取(qu)一定數量(liang)的(de)樣品進行質(zhi)量(liang)控制(zhi)分析(xi)：

化學(xue)檢(jian)(jian)測(ce)：使(shi)用低(di)溫凝固點的方法檢(jian)(jian)測(ce)滲透(tou)壓，以保證符合產(chan)品規(gui)范。我(wo)們每天使(shi)用國家(jia)標(biao)準(zhun)的技(ji)術研(yan)究所(suo)標(biao)定的標(biao)準(zhun)溶液(ye)(ye)對我(wo)們的滲透(tou)壓檢(jian)(jian)測(ce)儀器進行(xing)校準(zhun)。同樣(yang)每天使(shi)用國家(jia)標(biao)準(zhun)技(ji)術研(yan)究所(suo)標(biao)定的標(biao)準(zhun)溶液(ye)(ye)對pH計進行(xing)校準(zhun)。

使用(yong)(yong)電泳圖譜鑒定血清的(de)整(zheng)體性質。樣品被轉移到硝酸纖(xian)維素(su)基(ji)質中，并在緩沖(chong)體系內遷移。條(tiao)(tiao)帶經染色、清潔、干燥后用(yong)(yong)密度儀(yi)進行掃描(miao)，以檢測(ce)白蛋白和球蛋白組分的(de)相(xiang)對濃度。為證實是否(fou)在適當的(de)條(tiao)(tiao)件下進行采血和處理，使用(yong)(yong)修飾的(de)Fleming方法對血紅(hong)蛋白進行分光(guang)光(guang)度檢測(ce)。

隨著(zhu)動物年齡的(de)(de)增加，血(xue)清(qing)總(zong)蛋(dan)白含量也相應地提高。使(shi)用自動化的(de)(de)Biuret方(fang)法(fa)進行(xing)總(zong)血(xue)清(qing)蛋(dan)白的(de)(de)檢(jian)測，以確認動物年齡并驗證(zheng)符合(he)產品規范(fan)。使(shi)用色度計(ji)在(zai)不同波(bo)長下檢(jian)測樣品和Biuret試劑混合(he)波(bo)的(de)(de)吸光度。自動計(ji)算結(jie)果后，與(yu)標準(zhun)曲線比較，即可得到蛋(dan)白值(克/公升)。

穩定(ding)(ding)性(xing)檢測程序(xu)：在(zai)每一個標(biao)記為(wei)體外(wai)診斷的(de)產(chan)(chan)品上顯示的(de)效期(qi)表明(ming)了這個產(chan)(chan)品具(ju)有多(duo)長時間的(de)效能(neng)。我們的(de)穩定(ding)(ding)性(xing)程序(xu)確定(ding)(ding)和證明(ming)了產(chan)(chan)品效期(qi)。我們定(ding)(ding)期(qi)監測批量產(chan)(chan)品，確定(ding)(ding)產(chan)(chan)品在(zai)推(tui)薦貯存條件下具(ju)有可接受(shou)效果(guo)的(de)時間長度。

微(wei)生(sheng)物(wu)學檢(jian)(jian)測(ce)：所有血(xue)(xue)清(qing)使(shi)用(yong)Barile&Kern的(de)大體(ti)積方(fang)法(fa)檢(jian)(jian)測(ce)支原體(ti)。在(zai)(zai)推(tui)薦方(fang)法(fa)的(de)檢(jian)(jian)測(ce)范圍內(nei)檢(jian)(jian)測(ce)結果(guo)是準確(que)的(de)。樣(yang)品少應(ying)該在(zai)(zai)肉湯中(zhong)合并培(pei)養(yang)3個星(xing)期(qi)，同時(shi)要在(zai)(zai)瓊(qiong)脂平(ping)板上進(jin)行不少于4次傳代培(pei)養(yang)。在(zai)(zai)有氧和(he)厭氧(95%氮，5%CO2)條件下，平(ping)板在(zai)(zai)36±2℃下孵育。在(zai)(zai)檢(jian)(jian)測(ce)過程中(zhong)，每周對瓊(qiong)脂平(ping)板進(jin)行一(yi)次微(wei)生(sheng)物(wu)生(sheng)長(chang)情況檢(jian)(jian)驗(yan)。使(shi)用(yong)Dienes染(ran)(ran)色法(fa)對懷疑被污染(ran)(ran)的(de)瓊(qiong)脂平(ping)板進(jin)行支原體(ti)菌落的(de)檢(jian)(jian)測(ce)。然后，對平(ping)板進(jin)行再次鏡檢(jian)(jian)。對孵育肉湯瓶(ping)要定期(qi)進(jin)行濁(zhuo)度和(he)pH值(zhi)變動(dong)的(de)檢(jian)(jian)測(ce)。在(zai)(zai)推(tui)薦方(fang)法(fa)檢(jian)(jian)測(ce)范圍內(nei)，所有血(xue)(xue)清(qing)也(ye)要使(shi)用(yong)Hoechst熒光DNA染(ran)(ran)色法(fa)進(jin)行不可在(zai)(zai)肉湯中(zhong)培(pei)養(yang)的(de)支原體(ti)(包括(kuo)M.hyorhinis屬)檢(jian)(jian)測(ce)。

病(bing)毒(du)檢(jian)測(ce)：已知無外來(lai)物(wu)(wu)質的(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)培(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)養基須經過在包含(han)15%測(ce)試血清(qing)的(de)(de)(de)生長培(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)養基中進行(xing)為期21天(tian)的(de)(de)(de)三次傳(chuan)代培(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)養。使用對(dui)照(zhao)培(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)養基和(he)已知對(dui)外來(lai)物(wu)(wu)質為陰性的(de)(de)(de)血清(qing)平行(xing)地維(wei)持陰性對(dui)照(zhao)培(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)養。整個期間(jian)，檢(jian)測(ce)所有的(de)(de)(de)培(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)養情(qing)況，以便(bian)發(fa)(fa)現是否存在病(bing)毒(du)誘發(fa)(fa)的(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)形態改變或致(zhi)細(xi)胞(bao)病(bing)變效應。在1421天(tian)的(de)(de)(de)培(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)養期間(jian)，對(dui)含(han)有檢(jian)測(ce)血清(qing)的(de)(de)(de)平行(xing)培(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)養瓶按(an)下面標準病(bing)毒(du)檢(jian)測(ce)方法(fa)進行(xing)評估。

將其中一瓶(ping)檢(jian)測細(xi)(xi)胞用胰蛋白酶(mei)消化，然后把(ba)細(xi)(xi)胞分別加入到總面積為(wei)6cm 2 的(de)六(liu)室載玻片(pian)(pian)上。同時準備陰(yin)性對照載玻片(pian)(pian)。在檢(jian)測培養(yang)(yang)的(de)單(dan)室載玻片(pian)(pian)上加入牛病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)性腹瀉病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(BVDV)、牛細(xi)(xi)小病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)、牛腺病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)、狂(kuang)犬病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)和呼腸病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)的(de)染(ran)色劑(ji)，作為(wei)單(dan)個的(de)陽性對照。再經過7天(tian)培養(yang)(yang)(總共21天(tian))，利用熒(ying)光(guang)抗體(ti)技術檢(jian)測病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)。

通過對檢(jian)測培養進行蘇木精(jing)伊紅染色，觀察致細胞突變效應(ying)(CPE)或其(qi)他病(bing)毒誘(you)導效應(ying)。檢(jian)測細胞是否(fou)存在CPE效應(ying)、內(nei)含(han)物、多核(he)體(ti)或其(qi)他異常(chang)效應(ying)。

內(nei)毒素檢測：我們用阿米巴(ba)變形細胞溶解(jie)物(LAL)凝膠法來檢測胎牛血清(qing)的內(nei)毒素含量。

效能檢測：
對每一批次的(de)胎牛血清(qing)，我(wo)們(men)都(dou)進(jin)行下述(shu)培養(yang)效能(neng)檢(jian)測(ce)(ce)。選(xuan)擇(ze)血清(qing)重要的(de)標準(zhun)是其(qi)支持特(te)殊細胞的(de)生長(chang)能(neng)力。因此，除了保證血清(qing)通(tong)過嚴格的(de)品質控制，我(wo)們(men)也(ye)同時在實驗室條(tiao)件下對血清(qing)的(de)三個重要的(de)培養(yang)效能(neng)進(jin)行檢(jian)測(ce)(ce)：克隆效率、貼壁效果(guo)和二倍體成纖維細胞生長(chang)促進(jin)。

克隆效率分析：克隆效率實驗分析每一批胎牛血清促進小鼠骨髓瘤細胞及其衍生的雜交瘤細胞的克隆和生長能力。下列產品
經驗證可用于該實驗：
Sp2/0-Ag14(ATCC #CRL 1581)
P3x63-Ag8.653(ATCC #CRL 1580)

每(mei)一(yi)批(pi)胎牛(niu)血(xue)清都要(yao)分(fen)別在(zai)復制微量(liang)滴定(ding)平(ping)板(ban)上加入兩種血(xue)清濃(nong)度和兩種細胞接種量(liang)(10%血(xue)清和1cell/孔，4%血(xue)清和5cells/孔)的(de)情(qing)況下進(jin)行分(fen)析。克隆(long)分(fen)析結果除以已確定(ding)的(de)參照血(xue)清值得以歸一(yi)化。在(zai)許多日常(chang)雜交選擇(ze)程(cheng)序中具有(you)代(dai)表(biao)性的(de)是高濃(nong)度的(de)血(xue)清，而低濃(nong)度血(xue)清在(zai)設計血(xue)清批(pi)次細微差異放(fang)大(da)檢測中有(you)更為嚴格(ge)的(de)測試。嚴格(ge)的(de)1cell/孔測試是模擬單一(yi)雜交選擇(ze)的(de)實(shi)驗(yan)室(shi)條件。為每(mei)一(yi)批(pi)次胎牛(niu)血(xue)清提供的(de)分(fen)析證明報告中的(de)克隆(long)效率值為兩次測試條件下的(de)平(ping)均值。

克隆分析法：克隆分析法是在復式96孔板中加入兩種胎牛血清濃度(10%v/v)和(4%v/v)和兩種接種量的情況下進行的。每一次化驗中，同時測量前期已驗證合格的一批胎牛血清，并將此測量值作為內部參考標準。
克隆分析(xi)按下述方法進行：

1．Sp2/0-Ag14(sp2)和P3x63-Ag8.653(653)在含有10%的(de)胎牛血清的(de)RPM1640中通常保持對數(shu)生長期(qi)。在顯微鏡下，利用臺盼藍(lan)排除法對活細(xi)胞進行計數(shu)。

2．用RPM1640培(pei)養基將(jiang)儲備細(xi)胞懸浮液進行連續(xu)稀釋，使其達到預期的25cells/ml和5cells/ml接種濃度。準備含有參照或測(ce)試胎牛(niu)血清的RPM1640培(pei)養基。將(jiang)這種密度的細(xi)胞分配到各個分析生長培(pei)養基體積為0.2毫(hao)升的孔中，使其分別平均含有5個和1個細(xi)胞。

3．將96孔板放入(ru)36±2℃，4-6% CO 2 的潮濕(shi)培養箱(xiang)孵育(yu)約1015天。

4．在孵(fu)育期間，用(yong)肉眼(yan)觀察平板(ban)并(bing)對(dui)用(yong)于克(ke)隆的孔(kong)進行計數(shu)。克(ke)隆效率按下列方法計算(suan)：克(ke)隆效率=(陽性孔(kong)平均(jun)數(shu)/孵(fu)育孔(kong)總數(shu))×100%

5．每(mei)一批次胎(tai)牛血清(qing)(qing)維持(chi)指示劑(ji)骨髓瘤細(xi)胞(bao)克(ke)隆(long)(long)效率(lv)的(de)定量按照以(yi)下方法(fa)測(ce)得的(de)相對克(ke)隆(long)(long)效率(lv)(RCE)進行歸(gui)一化：RCE=檢(jian)測(ce)血清(qing)(qing)的(de)克(ke)隆(long)(long)效率(lv)/對照血清(qing)(qing)的(de)克(ke)隆(long)(long)效率(lv)貼壁效率(lv)分(fen)析：貼壁效率(lv)分(fen)析是(shi)利(li)用已轉型(xing)的(de)人類細(xi)胞(bao)系(xi)來(lai)檢(jian)測(ce)每(mei)一批血清(qing)(qing)促使持(chi)續(xu)貼附細(xi)胞(bao)系(xi)的(de)生長能(neng)力。選擇已被驗證可(ke)以(yi)檢(jian)測(ce)貼壁效率(lv)的(de)細(xi)胞(bao)系(xi)A549(人肺腫瘤細(xi)胞(bao)，ATCC#CCL,185)，是(shi)因為它可(ke)以(yi)區分(fen)一批血清(qing)(qing)維持(chi)細(xi)胞(bao)貼壁和繁殖能(neng)力的(de)細(xi)微差(cha)異。

每一(yi)批(pi)(pi)次胎(tai)牛血(xue)清(qing)都(dou)要(yao)在兩種(zhong)(zhong)血(xue)清(qing)濃(nong)度(du)(du)和兩種(zhong)(zhong)細(xi)胞(bao)接種(zhong)(zhong)濃(nong)度(du)(du)下(xia)(10%血(xue)清(qing)和100cells/孔(kong)，4%血(xue)清(qing)和200cells/孔(kong))測試(shi)(shi)三(san)次。在36±2℃，4-6% CO 2 的潮濕培養箱孵育約1014天，對被(bei)染色的細(xi)胞(bao)菌落進(jin)行計數即可得(de)到其貼壁效率(lv)。將結果(guo)除以(yi)參考(kao)的對照血(xue)清(qing)得(de)以(yi)歸一(yi)化。通過兩種(zhong)(zhong)血(xue)清(qing)濃(nong)度(du)(du)的測試(shi)(shi)，可以(yi)驗證該批(pi)(pi)次血(xue)清(qing)在減量和標準水平下(xia)維持(chi)生長的能力。為(wei)每一(yi)批(pi)(pi)次胎(tai)牛血(xue)清(qing)提供(gong)的分析證明報告中的貼壁效率(lv)值為(wei)兩次測試(shi)(shi)條件下(xia)的平均值。

貼壁分析(xi)法(fa)：使用貼附分析(xi)檢(jian)測上述每(mei)一批測試血清(qing)。這種分析(xi)法(fa)針對每(mei)一個血清(qing)樣品使用一個6孔板(每(mei)室9.6cm 2 )，并(bing)可(ke)以對三個孔的(de)數據進行平(ping)均處理。每(mei)一次化驗(yan)中(zhong)，同時測量前期已驗(yan)證合格的(de)一批胎牛血清(qing)，并(bing)將此測量值作為內部(bu)參考標準。

貼附分析(xi)按下述方法進行：

1．A549細(xi)胞系(xi)用含有10%胎牛血(xue)清的DMEM培養基(ji)，在36±2℃，以亞融合密度下進行培養。

2．含10%(v/v)和(he)4%(v/v)血清的(de)DMEM由分(fen)別(bie)在(zai)22.5毫升(sheng)(sheng)(sheng)和(he)24毫升(sheng)(sheng)(sheng)DMEM中加入(ru)2.5毫升(sheng)(sheng)(sheng)和(he)1毫升(sheng)(sheng)(sheng)胎牛血清配制(zhi)而(er)成，終有效體積為25毫升(sheng)(sheng)(sheng)。將(jiang)5毫升(sheng)(sheng)(sheng)含血清培養基分(fen)別(bie)加入(ru)6孔板的(de)每一個孔中。

3．A549培養細胞先經過胰蛋白酶消化(hua)，測定(ding)活細胞數(shu)，然后稀釋細胞懸浮液2,000cells/ml。

4．將0.1毫升(sheng)細胞(bao)懸(xuan)浮(fu)液加(jia)入(ru)200cells/孔(kong)室(shi)中，0.05毫升(sheng)懸(xuan)浮(fu)液加(jia)入(ru)100cells/孔(kong)室(shi)中。平板混合后放入(ru)36±2℃，5%CO 2 的(de)潮(chao)濕培養(yang)箱孵(fu)育約1014天。

5．孵(fu)育后，取(qu)出平板，去除生長(chang)培養基，用亞(ya)甲基蘭(lan)-甲醇溶(rong)液對菌落進行(xing)染色。

6．計算菌落(luo)形成，然后按(an)下述方法計算貼壁效率：%貼壁效率=每孔菌落(luo)平(ping)均數(shu)/每孔孵(fu)育活細胞平(ping)均數(shu)×100

7．為(wei)方便(bian)比較，將測(ce)(ce)得的(de)貼(tie)(tie)壁(bi)效(xiao)(xiao)率數(shu)值除以每批(pi)檢測(ce)(ce)血清的(de)相(xiang)對貼(tie)(tie)壁(bi)效(xiao)(xiao)率(RPE)得以歸一化(hua)：RCE=檢測(ce)(ce)血清的(de)貼(tie)(tie)壁(bi)效(xiao)(xiao)率/參(can)照血清的(de)貼(tie)(tie)壁(bi)效(xiao)(xiao)率二倍體成纖維(wei)細胞(bao)生長：促進生長分析用于檢測(ce)(ce)每一批(pi)胎牛(niu)血清維(wei)持難培養的(de)人二倍體成纖維(wei)細胞(bao)長期生長的(de)能力。

下列細胞系經認(ren)證可用于該實驗：

WI-38(人二倍體肺成纖維(wei)細胞(bao)，ATCC#CCL 75)

WI-38細(xi)胞(bao)(bao)在(zai)含5%胎(tai)牛(niu)血(xue)清(qing)的(de)低密(mi)度(2X10 5 /瓶)復式(shi)25-cm 2瓶中孵(fu)育，并進(jin)行為(wei)期三個連續7天的(de)傳代培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)。在(zai)每(mei)(mei)一個培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)期，細(xi)胞(bao)(bao)都從初始孵(fu)育密(mi)度開始傳代培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)。壓(ya)力分(fen)層(ceng)率、成倍繁(fan)殖數量和減(jian)量血(xue)清(qing)濃度是每(mei)(mei)批(pi)次(ci)(ci)(ci)促(cu)進(jin)難培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)二倍體細(xi)胞(bao)(bao)的(de)生(sheng)長(chang)(chang)血(xue)清(qing)的(de)嚴格測(ce)(ce)試指標。通過連續三代培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)以減(jian)少前(qian)一次(ci)(ci)(ci)生(sheng)長(chang)(chang)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)基的(de)殘(can)留影響，從而(er)保證得到(dao)檢測(ce)(ce)批(pi)促(cu)進(jin)生(sheng)長(chang)(chang)能力的(de)真實結(jie)果。為(wei)每(mei)(mei)一批(pi)次(ci)(ci)(ci)胎(tai)牛(niu)血(xue)清(qing)提供的(de)分(fen)析證明(ming)報告為(wei)第三次(ci)(ci)(ci)傳代培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)每(mei)(mei)復式(shi)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)瓶細(xi)胞(bao)(bao)數的(de)平均值。將檢測(ce)(ce)值除(chu)以參考對照值得以歸一化。

二倍體(ti)成纖維細胞生(sheng)長(chang)(chang)分析法：培(pei)養(yang)數代WI-38人類二倍體(ti)肺成纖維細胞，計(ji)算每一(yi)代的(de)細胞總(zong)數。此項檢測所(suo)挑選出(chu)的(de)胎牛血清批號能維持難以生(sheng)長(chang)(chang)細胞、貼(tie)壁性細胞、正常的(de)細胞株(zhu)生(sheng)長(chang)(chang)及存活。

1．準備含5%檢測血(xue)清或(huo)已(yi)驗證(zheng)合格的(de)參照血(xue)清生(sheng)(sheng)長(chang)培(pei)養基，基礎生(sheng)(sheng)長(chang)培(pei)養基為含L-谷氨酰胺(an)的(de)HBME：EBME(1：1)。按要求(qiu)，在每一次流量(liang)變化(hua)和分析過程中進(jin)行傳代培(pei)養時需配制(zhi)含5%血(xue)清生(sheng)(sheng)長(chang)的(de)培(pei)養基。

2．在低(di)代培養(yang)水平時(shi)，將(jiang)2X10 5 WI-38細(xi)胞加入(ru)各個(ge)含9.5毫升生長培養(yang)基的復式25-cm 2 培養(yang)基中。在不擰(ning)緊瓶(ping)(ping)蓋(gai)(gai)的情(qing)況下，將(jiang)培養(yang)瓶(ping)(ping)放(fang)入(ru)4-6%CO 2， 36℃±2℃環(huan)境(jing)中，保持24小時(shi)。然后(hou)擰(ning)緊瓶(ping)(ping)蓋(gai)(gai)，將(jiang)培養(yang)瓶(ping)(ping)放(fang)在36℃±2℃下孵育(yu)7天，在第2天或第3天全部(bu)更換培養(yang)基。

3．在(zai)第(di)7天，用胰蛋白(bai)酶對每一個含參照或檢測血(xue)(xue)清(qing)的復式瓶中(zhong)(zhong)的細胞(bao)進行消化得到一定數(shu)量細胞(bao)，然后合并(bing)并(bing)計數(shu)。將(jiang)2x10 5 WI-38細胞(bao)加入(ru)含有(you)新(xin)鮮生(sheng)長培(pei)養(yang)(yang)(yang)基(已加入(ru)了與上一代同(tong)一批次(ci)的參照或檢測胎牛血(xue)(xue)清(qing))的新(xin)的復式25-cm 2 瓶中(zhong)(zhong)，進行細胞(bao)傳(chuan)代培(pei)養(yang)(yang)(yang)。按(an)第(di)2步(bu)所述，將(jiang)培(pei)養(yang)(yang)(yang)瓶進行平衡并(bing)孵育。

4．如上所述經過三(san)代(dai)連續分析，在每(mei)一(yi)代(dai)結(jie)束時計(ji)算每(mei)一(yi)批參照或檢(jian)測血清(qing)的(de)每(mei)瓶細(xi)胞(bao)平均(jun)數。后一(yi)代(dai)培養的(de)各(ge)批檢(jian)測血清(qing)實驗(yan)中的(de)相對生長(chang)率(RGR)作為參照血清(qing)實驗(yan)中獲得(de)的(de)細(xi)胞(bao)生長(chang)率分子：

%RGR=檢測血(xue)(xue)清(qing)(qing)實(shi)驗中(zhong)每(mei)瓶平均(jun)細(xi)胞(bao)數/參(can)照血(xue)(xue)清(qing)(qing)實(shi)驗中(zhong)每(mei)瓶平均(jun)細(xi)胞(bao)數X100S f9細(xi)胞(bao)生長(chang)促進(jin)分(fen)析(xi)。通過昆蟲分(fen)析(xi)可以保(bao)證您購買的胎(tai)牛(niu)血(xue)(xue)清(qing)(qing)批次(ci)可以維(wei)持S f9細(xi)胞(bao)的生長(chang)。收(shou)到產(chan)品后，您需要(yao)做的就是混(hun)勻血(xue)(xue)清(qing)(qing)，在(zai)56℃下熱(re)滅活30分(fen)鐘。這種分(fen)析(xi)法(fa)也(ye)可以用(yong)于(yu)乳白蛋白水(shui)解產(chan)品、酵母和其它生長(chang)輔料(liao)作為原料(liao)的生物效能(neng)分(fen)析(xi)。該分(fen)析(xi)法(fa)的準確(que)性取決(jue)于(yu)是否用(yong)常規的細(xi)胞(bao)培養(yang)(yang)方案進(jin)行培養(yang)(yang)。用(yong)臺(tai)盼藍染(ran)色排除法(fa)測得(de)的細(xi)胞(bao)活性少不低于(yu)80%。

細胞生長分析法。

1．使用含10%檢測或參照熱(re)滅活(huo)胎牛血清的(de)已驗(yan)證的(de)Grace昆明培養(yang)基配制*檢測培養(yang)基。

2．將儲備Sf9細(xi)胞加入50毫升(sheng)離心管中，在50Xg下離心5分鐘。然后(hou)將每支試(shi)管的沉淀(dian)物重新用含10%的檢測或參照熱滅活胎牛血清*培養基配(pei)制(zhi)成懸浮液。

3．反試管顛倒(dao)幾次，然(ran)后(hou)每支試管倒(dao)出1毫升樣品。用(yong)臺盼藍染色排除進(jin)行活細胞計數(shu)。

4．如果活(huo)性≥80%，把試管再顛倒(dao)幾次(ci)并取出0.25毫升樣品(pin)。然后(hou)用Coulter計數器(qi)進行細胞計數。

5．將細胞加入Erlenmeyer瓶中，使其終細胞濃度為2.75X10 5 cells/ml。孵育后，再一次進行細胞計(ji)數，以保(bao)證(zheng)細胞密(mi)度為2.5X10 5 3.0X10 5 cells/ml。

6．將培養瓶(ping)放到搖(yao)床上，在27℃±1℃、80-90rpm條件(jian)下孵育(yu)96小時。

7．從(cong)每一培養瓶中分別取(qu)出0.25毫升樣品，用Coulter計數器進行計數。同時取(qu)出一定量的(de)樣品進行細胞活(huo)性檢測。

8．將檢測細胞(bao)密度(du)(du)與參照(zhao)細胞(bao)密度(du)(du)相比即可得到相對細胞(bao)密度(du)(du)(RCN)。

噬(shi)菌(jun)體檢測(ce):我(wo)們(men)利用(yong)溶(rong)菌(jun)斑分(fen)析(xi)法來檢測(ce)是(shi)否存在噬(shi)菌(jun)體。從每一批血清中取具代表性的樣品加入(ru)胰蛋白酶磷(lin)(lin)酸瓊(qiong)脂中，并在其加入(ru)含有噬(shi)菌(jun)體敏感的大腸(chang)桿菌(jun)懸(xuan)浮液(C-3000或(huo)K-12)。然(ran)后，混(hun)合(he)物會(hui)在胰蛋白酶磷(lin)(lin)酸瓊(qiong)脂平(ping)(ping)板上分(fen)層，在36±2℃環境下孵育(yu)約24小時后，觀察平(ping)(ping)板上溶(rong)菌(jun)斑的形態。

生化特征檢測。

血(xue)紅(hong)蛋(dan)白(bai)檢測：所有批次的胎牛血(xue)清(qing)我們(men)都進(jin)行(xing)了血(xue)紅(hong)蛋(dan)白(bai)的檢測，血(xue)紅(hong)蛋(dan)白(bai)含量(liang)低(di)于(yu)《中國生(sheng)物制品(pin)主要原輔材料指控(kong)指標》(2000年版)公布的指標。

效能檢測：其它血清

新生(sheng)牛血清。檢測(ce)新生(sheng)牛血清維持超過(guo)三代(dai)VERO細胞(bao)生(sheng)長的能力。在每一個(ge)培(pei)養(yang)期，細胞(bao)都從初始(shi)孵育(yu)密度開始(shi)傳代(dai)培(pei)養(yang)。可將所得結(jie)果(guo)與使用含有(you)已知(zhi)特征的參(can)照血清對(dui)照生(sheng)長培(pei)養(yang)基獲(huo)得的平行結(jie)果(guo)進行比較(jiao)。

馬血(xue)清(qing)。每一(yi)批馬血(xue)清(qing)被檢測維持在含有檢測批血(xue)清(qing)的對照(zhao)培(pei)養基上Sp2/0-Ag14(小鼠骨(gu)髓瘤)細胞生長的能力。可將所得(de)結果(guo)與使用含有已知(zhi)特征的參照(zhao)血(xue)清(qing)對照(zhao)生長培(pei)養基獲得(de)的平(ping)行(xing)結果(guo)進行(xing)比較。

血清(qing)的(de)使(shi)用與儲(chu)存：正(zheng)確的(de)使(shi)用及保存血清(qing)，才(cai)能(neng)使(shi)血清(qing)發揮應有的(de)作(zuo)用。

1. 儲(chu)存(cun)(cun)(cun)條件：血(xue)(xue)清(qing)(qing)一般儲(chu)存(cun)(cun)(cun)于(yu)(yu)－20℃，同(tong)時應避(bi)免(mian)反復凍融(rong)。購買(mai)大包(bao)裝的血(xue)(xue)清(qing)(qing)后(hou)，先(xian)要滅活(huo)處理，然后(hou)分裝成小包(bao)裝，儲(chu)存(cun)(cun)(cun)于(yu)(yu)－20℃，使用(yong)前融(rong)化(hua)。融(rong)化(hua)時好先(xian)置于(yu)(yu)4℃。融(rong)化(hua)后(hou)的血(xue)(xue)清(qing)(qing)在4℃不宜長時間存(cun)(cun)(cun)放，應盡快使用(yong)。

2. 使(shi)用濃度：自從有了合(he)成培養基(ji)，血清就是作為一(yi)種添(tian)加(jia)成分(fen)與(yu)合(he)成培養基(ji)混合(he)使(shi)用，使(shi)用濃度一(yi)般為5－20％，常用是10％。過多(duo)血清容易使(shi)培養中的(de)細胞發生(sheng)變化(hua)，特別是一(yi)些(xie)二倍體(ti)的(de)無限細胞系，迅速生(sheng)長之后容易發生(sheng)惡性(xing)轉化(hua)。

關于使用中的(de)常見問(wen)題

1.保存血清好的辦法？
我(wo)們建議血清應(ying)保存(cun)在(zai)-5℃-20℃。若你一(yi)次無法用(yong)完一(yi)瓶，建議您(nin)無菌分(fen)裝血清恰當的(de)滅菌容器內(nei)，再(zai)放回(hui)冷凍。

2.如何解凍血清才不會使產品質量受損？
我(wo)們建議您將血清從冷凍(dong)箱中(zhong)取(qu)出后，先置于2-8℃冰箱中(zhong)使之(zhi)(zhi)溶解(jie)，然(ran)后在室溫下使之(zhi)(zhi)全溶。但必須注意的是，溶解(jie)過程中(zhong)必須規則地(di)搖晃(huang)均勻。

3.血清解凍后發現有絮狀沉淀物出現，該如何處理？
血清中沉淀物的出現有許多原因，但普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性造成的；而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解凍后，也會存在于血清中，亦是造成血清沉淀物的主要原因之一。但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質量。
若(ruo)您欲去除這些絮狀(zhuang)沉淀物(wu)，可以(yi)將血清分裝無(wu)菌離(li)心(xin)管中，以(yi)400g稍微離(li)心(xin)，上(shang)清液即可接著加入培(pei)養基內一(yi)起過濾。我們不(bu)建議您以(yi)過濾的方法去除這些絮狀(zhuang)沉淀物(wu)，因為它可能會阻塞(sai)您的過濾膜。

4.何謂熱滅活？有必要做熱滅活嗎？
一般以56℃，30分鐘水浴來處理已解凍的血清，因為此加熱步驟，可以使補體去活性，而補體所參與的反應有：溶細胞活性，平滑肌的收縮，肥大細胞和血小板組胺的釋放，增強吞噬作用，淋巴細胞、巨噬細胞的趨化和激活。實驗顯示，經過正確處理的熱滅活血清，對大多數的細胞而言是不需要的。經過處理的血清對細胞生長只有微小的促進，或*沒有任何作用，甚通常因為高溫處理影響了血清的質量，而造成細胞生長速率的降低。
而經過熱處理的血(xue)(xue)(xue)清(qing)，沉淀(dian)物(wu)的形成會(hui)顯著的增多，這(zhe)(zhe)些沉淀(dian)物(wu)在(zai)倒置顯微(wei)鏡下觀察，像是(shi)“小黑點”，常常會(hui)讓研(yan)究者(zhe)(zhe)誤以(yi)(yi)為是(shi)血(xue)(xue)(xue)清(qing)遭受污(wu)染，而把血(xue)(xue)(xue)清(qing)放在(zai)37℃環境(jing)中，又會(hui)使此(ci)沉淀(dian)物(wu)更增多，使研(yan)究者(zhe)(zhe)認(ren)為是(shi)微(wei)生(sheng)物(wu)的分(fen)裂擴增。因此(ci)我們(men)建議您(nin)(nin)，若非(fei)必須，您(nin)(nin)可以(yi)(yi)不需(xu)要做熱滅活(huo)這(zhe)(zhe)一步。如此(ci)以(yi)(yi)來，不但(dan)節(jie)省您(nin)(nin)寶貴(gui)的時間，更確保您(nin)(nin)血(xue)(xue)(xue)清(qing)的質(zhi)量！

5.如何避免沉淀物的出現？
我們建議您在使用血(xue)(xue)(xue)清(qing)的(de)時候(hou)，注意(yi)正(zheng)確的(de)血(xue)(xue)(xue)清(qing)解凍步驟，并(bing)盡量避免滅活血(xue)(xue)(xue)清(qing)及長時間(jian)的(de)將血(xue)(xue)(xue)清(qing)置(zhi)于高溫環境中。

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