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無噬(shi)菌體，低內毒素特級胎牛血清 

四(si)季青 無噬菌體，低內毒素特級胎(tai)牛(niu)血(xue)清通常作為補充(chong)成(cheng)分(fen)(fen)添(tian)加在基(ji)(ji)礎(chu)(chu)培養(yang)(yang)基(ji)(ji)內使用。它(ta)能(neng)夠提供(gong)各(ge)種大分(fen)(fen)子(zi)蛋(dan)白，小分(fen)(fen)子(zi)量營養(yang)(yang)，水溶性成(cheng)分(fen)(fen)的(de)(de)轉運蛋(dan)白，和(he)其它(ta)一些(xie)細胞(bao)在體外(wai)所必(bi)需的(de)(de)成(cheng)分(fen)(fen)，如激素和(he)附(fu)著因子(zi)。血(xue)清可以結合(he)或中(zhong)和(he)一些(xie)生長因子(zi)中(zhong)的(de)(de)有毒成(cheng)分(fen)(fen)，并提供(gong)培養(yang)(yang)基(ji)(ji)的(de)(de)緩沖能(neng)力。細胞(bao)培養(yang)(yang)時血(xue)清的(de)(de)添(tian)加依賴于基(ji)(ji)礎(chu)(chu)培養(yang)(yang)基(ji)(ji)的(de)(de)化(hua)學組成(cheng)，培養(yang)(yang)細胞(bao)的(de)(de)類型，及所用的(de)(de)培養(yang)(yang)系統。

我們(men)在提供(gong)細胞培(pei)養基、平衡鹽溶(rong)液、無血清(qing)培(pei)養基和(he)(he)試劑(ji)的(de)(de)同(tong)時，還提供(gong)高(gao)品(pin)(pin)質的(de)(de)血清(qing)。我們(men)對(dui)血清(qing)制(zhi)備進(jin)行(xing)全過程(cheng)監管(guan)。從血清(qing)收集到終產品(pin)(pin)檢驗(yan)和(he)(he)內(nei)部(bu)稽(ji)核的(de)(de)每一(yi)個(ge)(ge)步(bu)驟，我們(men)都采用設備和(he)(he)標(biao)準操作程(cheng)序，以(yi)確保整個(ge)(ge)過程(cheng)中每個(ge)(ge)環節的(de)(de)產品(pin)(pin)質量。對(dui)整個(ge)(ge)過程(cheng)的(de)(de)控制(zhi)可以(yi)保證產品(pin)(pin)的(de)(de)持(chi)續高(gao)品(pin)(pin)質，降低(di)不(bu)同(tong)批次的(de)(de)差(cha)異(yi)。

處理(li)(li)：全(quan)部血(xue)(xue)(xue)清：收集(ji)的(de)血(xue)(xue)(xue)液均在冷藏(zang)條(tiao)件(jian)下處理(li)(li)。血(xue)(xue)(xue)清和(he)血(xue)(xue)(xue)塊分離后立即將血(xue)(xue)(xue)清合(he)并并冷凍(dong)。只有符合(he)我(wo)們的(de)檢(jian)測標準的(de)血(xue)(xue)(xue)清才被接(jie)受作進一(yi)步處理(li)(li)。

熱(re)(re)滅活(huo)血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)：熱(re)(re)滅活(huo)是在56℃水(shui)浴中嚴格控(kong)溫(wen)30分(fen)鐘。透(tou)(tou)析(xi)血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)：用10,000截留分(fen)子量(liang)的(de)(de)透(tou)(tou)析(xi)膜(mo)在0.15M的(de)(de)NaCl中進(jin)行(xing)透(tou)(tou)析(xi)，直到葡萄糖水(shui)平低于5mg/dl(用鄰甲(jia)苯胺測試法(fa)(fa)檢驗)。γ射(she)線(xian)照(zhao)(zhao)射(she)血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)：可按(an)客(ke)戶要求(qiu)對血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)進(jin)行(xing)γ射(she)線(xian)照(zhao)(zhao)射(she)。通(tong)過(guo)(guo)γ射(she)線(xian)照(zhao)(zhao)射(she)以滅活(huo)各種動(dong)物血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(包括(kuo)(kuo)胎牛血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)、新生牛血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)、豬血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)和馬血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing))中的(de)(de)病(bing)毒和支原體的(de)(de)方法(fa)(fa)已經(jing)得到證(zheng)實。研(yan)究證(zheng)實照(zhao)(zhao)射(she)劑量(liang)在30-45kGy為宜。血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)在此(ci)照(zhao)(zhao)射(she)后物理化(hua)學特(te)性和細胞培養(yang)表現沒有變化(hua)。裝瓶：粗血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)須通(tong)過(guo)(guo)一系列的(de)(de)過(guo)(guo)濾才成為成品。后的(de)(de)過(guo)(guo)濾步驟包括(kuo)(kuo)使用0.2um和0.1um的(de)(de)無菌(jun)過(guo)(guo)濾。胎牛血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)須通(tong)過(guo)(guo)三次(ci)(ci)0.1um過(guo)(guo)濾，其他血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)須通(tong)過(guo)(guo)0.2um過(guo)(guo)濾。終產品的(de)(de)質量(liang)控(kong)制(zhi)：我們采取以下(xia)方法(fa)(fa)對每一批次(ci)(ci)的(de)(de)產品選取一定數量(liang)的(de)(de)樣品進(jin)行(xing)質量(liang)控(kong)制(zhi)分(fen)析(xi)：

化學檢(jian)測(ce)：使用低溫凝(ning)固點(dian)的方法檢(jian)測(ce)滲(shen)透壓，以保證符合產品(pin)規(gui)范。我(wo)們(men)每(mei)天使用國家(jia)標(biao)(biao)準(zhun)的技(ji)術研究(jiu)所標(biao)(biao)定(ding)的標(biao)(biao)準(zhun)溶液對我(wo)們(men)的滲(shen)透壓檢(jian)測(ce)儀器進行(xing)校準(zhun)。同樣每(mei)天使用國家(jia)標(biao)(biao)準(zhun)技(ji)術研究(jiu)所標(biao)(biao)定(ding)的標(biao)(biao)準(zhun)溶液對pH計進行(xing)校準(zhun)。

使用電(dian)泳圖譜鑒(jian)定血清的整體(ti)性(xing)質(zhi)。樣(yang)品(pin)被轉移(yi)到硝酸纖維素(su)基(ji)質(zhi)中，并在緩沖體(ti)系(xi)內遷移(yi)。條帶經(jing)染色、清潔、干燥后用密(mi)度儀進(jin)行(xing)掃描，以(yi)檢測白(bai)(bai)蛋白(bai)(bai)和(he)球蛋白(bai)(bai)組分(fen)的相(xiang)對濃度。為證(zheng)實是(shi)否(fou)在適當的條件下進(jin)行(xing)采血和(he)處理，使用修飾(shi)的Fleming方法對血紅蛋白(bai)(bai)進(jin)行(xing)分(fen)光(guang)光(guang)度檢測。

隨(sui)著動(dong)物(wu)年齡的增加，血清(qing)總蛋(dan)白(bai)含量也相應地提高(gao)。使用(yong)自動(dong)化的Biuret方法進行總血清(qing)蛋(dan)白(bai)的檢(jian)測(ce)，以確認(ren)動(dong)物(wu)年齡并驗(yan)證(zheng)符合產品規范。使用(yong)色度計在不同波長下(xia)檢(jian)測(ce)樣品和(he)Biuret試劑混合波的吸(xi)光度。自動(dong)計算結果(guo)后，與(yu)標準曲線比較，即可得到蛋(dan)白(bai)值(zhi)(克(ke)/公升(sheng))。

穩(wen)定(ding)性(xing)檢測(ce)程(cheng)序：在每一個標記(ji)為體外診斷(duan)的(de)產品(pin)(pin)(pin)上(shang)顯示的(de)效(xiao)期表明了這個產品(pin)(pin)(pin)具(ju)(ju)有多長時間的(de)效(xiao)能。我(wo)們的(de)穩(wen)定(ding)性(xing)程(cheng)序確(que)定(ding)和證明了產品(pin)(pin)(pin)效(xiao)期。我(wo)們定(ding)期監測(ce)批量產品(pin)(pin)(pin)，確(que)定(ding)產品(pin)(pin)(pin)在推(tui)薦貯存(cun)條(tiao)件(jian)下(xia)具(ju)(ju)有可接受(shou)效(xiao)果的(de)時間長度。

微(wei)生物學(xue)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)：所有(you)血清使用Barile&Kern的(de)(de)大體(ti)積方法(fa)(fa)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)支(zhi)原體(ti)。在(zai)(zai)(zai)推薦方法(fa)(fa)的(de)(de)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)范圍(wei)內檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)結(jie)果(guo)是準確的(de)(de)。樣品少(shao)應該在(zai)(zai)(zai)肉湯中合(he)并培養3個星期，同時要在(zai)(zai)(zai)瓊(qiong)(qiong)(qiong)脂平(ping)板(ban)上(shang)進(jin)(jin)行(xing)(xing)不(bu)少(shao)于4次(ci)傳代培養。在(zai)(zai)(zai)有(you)氧(yang)和厭氧(yang)(95%氮(dan)，5%CO2)條件下，平(ping)板(ban)在(zai)(zai)(zai)36±2℃下孵育(yu)。在(zai)(zai)(zai)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)過(guo)程(cheng)中，每周對(dui)瓊(qiong)(qiong)(qiong)脂平(ping)板(ban)進(jin)(jin)行(xing)(xing)一次(ci)微(wei)生物生長情(qing)況檢(jian)(jian)驗(yan)。使用Dienes染(ran)色法(fa)(fa)對(dui)懷疑被污染(ran)的(de)(de)瓊(qiong)(qiong)(qiong)脂平(ping)板(ban)進(jin)(jin)行(xing)(xing)支(zhi)原體(ti)菌落的(de)(de)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)。然后，對(dui)平(ping)板(ban)進(jin)(jin)行(xing)(xing)再次(ci)鏡(jing)檢(jian)(jian)。對(dui)孵育(yu)肉湯瓶要定(ding)期進(jin)(jin)行(xing)(xing)濁度和pH值變(bian)動的(de)(de)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)。在(zai)(zai)(zai)推薦方法(fa)(fa)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)范圍(wei)內，所有(you)血清也(ye)要使用Hoechst熒(ying)光(guang)DNA染(ran)色法(fa)(fa)進(jin)(jin)行(xing)(xing)不(bu)可(ke)在(zai)(zai)(zai)肉湯中培養的(de)(de)支(zhi)原體(ti)(包(bao)括(kuo)M.hyorhinis屬(shu))檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)。

病毒(du)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)：已(yi)知(zhi)無外(wai)來物(wu)質的(de)細胞(bao)培(pei)養(yang)基(ji)須經過在(zai)包含15%測(ce)(ce)試血清的(de)生長培(pei)養(yang)基(ji)中進行(xing)為(wei)期21天的(de)三(san)次傳代培(pei)養(yang)。使用對(dui)照培(pei)養(yang)基(ji)和已(yi)知(zhi)對(dui)外(wai)來物(wu)質為(wei)陰性(xing)的(de)血清平(ping)行(xing)地維(wei)持(chi)陰性(xing)對(dui)照培(pei)養(yang)。整個期間(jian)，檢(jian)(jian)測(ce)(ce)所有(you)的(de)培(pei)養(yang)情況，以便發(fa)現是否存在(zai)病毒(du)誘發(fa)的(de)細胞(bao)形態改變或致(zhi)細胞(bao)病變效應。在(zai)1421天的(de)培(pei)養(yang)期間(jian)，對(dui)含有(you)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)血清的(de)平(ping)行(xing)培(pei)養(yang)瓶按下面標準病毒(du)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)方法進行(xing)評估。

將其中一(yi)瓶檢(jian)測細胞(bao)用胰蛋白酶(mei)消化，然后把細胞(bao)分別加入(ru)到總面(mian)積為(wei)6cm 2 的(de)六室載玻片上(shang)。同時準備陰性(xing)對照載玻片。在檢(jian)測培養(yang)的(de)單室載玻片上(shang)加入(ru)牛(niu)病(bing)(bing)毒性(xing)腹瀉病(bing)(bing)毒(BVDV)、牛(niu)細小病(bing)(bing)毒、牛(niu)腺病(bing)(bing)毒、狂犬(quan)病(bing)(bing)毒和呼腸病(bing)(bing)毒的(de)染色劑(ji)，作為(wei)單個的(de)陽性(xing)對照。再經過7天(tian)培養(yang)(總共21天(tian))，利用熒光抗體技術檢(jian)測病(bing)(bing)毒。

通過對檢測培(pei)養進行蘇木精(jing)伊紅染(ran)色，觀察致(zhi)細胞突變效(xiao)應(ying)(ying)(CPE)或(huo)其他(ta)病毒誘導效(xiao)應(ying)(ying)。檢測細胞是否存在CPE效(xiao)應(ying)(ying)、內含物、多核體或(huo)其他(ta)異常效(xiao)應(ying)(ying)。

內(nei)毒(du)素檢測：我們用阿米巴變形細胞溶(rong)解(jie)物(LAL)凝膠法來檢測胎(tai)牛血(xue)清的內(nei)毒(du)素含量。

效能檢測：
對每一(yi)批次的(de)(de)胎牛血(xue)清(qing)，我(wo)們(men)都(dou)進(jin)行下(xia)述(shu)培(pei)養效(xiao)能檢(jian)測。選擇血(xue)清(qing)重要的(de)(de)標(biao)準是其支持特殊細胞的(de)(de)生長能力。因此，除了保證血(xue)清(qing)通(tong)過嚴格的(de)(de)品(pin)質控制(zhi)，我(wo)們(men)也同時在實驗室條件(jian)下(xia)對血(xue)清(qing)的(de)(de)三個重要的(de)(de)培(pei)養效(xiao)能進(jin)行檢(jian)測：克隆效(xiao)率、貼壁效(xiao)果和二(er)倍體成纖維(wei)細胞生長促進(jin)。

克隆效率分析：克隆效率實驗分析每一批胎牛血清促進小鼠骨髓瘤細胞及其衍生的雜交瘤細胞的克隆和生長能力。下列產品
經驗證可用于該實驗：
Sp2/0-Ag14(ATCC #CRL 1581)
P3x63-Ag8.653(ATCC #CRL 1580)

每一批胎牛(niu)血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)(qing)都要分(fen)(fen)別在復制微量滴(di)定平板上加(jia)入兩種血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)(qing)濃(nong)度和兩種細(xi)胞接種量(10%血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)(qing)和1cell/孔(kong)，4%血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)(qing)和5cells/孔(kong))的(de)(de)(de)情況下(xia)進(jin)行分(fen)(fen)析(xi)(xi)。克(ke)隆分(fen)(fen)析(xi)(xi)結果(guo)除以已(yi)確定的(de)(de)(de)參照血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)(qing)值得以歸(gui)一化。在許(xu)多日常(chang)雜(za)交(jiao)選擇(ze)程序中具有代表性(xing)的(de)(de)(de)是高(gao)濃(nong)度的(de)(de)(de)血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)(qing)，而低濃(nong)度血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)(qing)在設計血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)(qing)批次細(xi)微差異放大檢(jian)測(ce)中有更為嚴(yan)格的(de)(de)(de)測(ce)試(shi)。嚴(yan)格的(de)(de)(de)1cell/孔(kong)測(ce)試(shi)是模擬(ni)單一雜(za)交(jiao)選擇(ze)的(de)(de)(de)實驗室條件。為每一批次胎牛(niu)血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)(qing)提供的(de)(de)(de)分(fen)(fen)析(xi)(xi)證(zheng)明報(bao)告(gao)中的(de)(de)(de)克(ke)隆效率值為兩次測(ce)試(shi)條件下(xia)的(de)(de)(de)平均值。

克隆分析法：克隆分析法是在復式96孔板中加入兩種胎牛血清濃度(10%v/v)和(4%v/v)和兩種接種量的情況下進行的。每一次化驗中，同時測量前期已驗證合格的一批胎牛血清，并將此測量值作為內部參考標準。
克(ke)隆分析(xi)按下(xia)述(shu)方(fang)法進(jin)行(xing)：

1．Sp2/0-Ag14(sp2)和P3x63-Ag8.653(653)在含有10%的胎牛血清的RPM1640中通常(chang)保持對數生長期。在顯微鏡(jing)下，利(li)用(yong)臺盼(pan)藍排除法對活(huo)細胞進行計數。

2．用RPM1640培(pei)養(yang)基(ji)(ji)(ji)將(jiang)儲備細胞懸浮液進行連續稀釋(shi)，使其達(da)到(dao)預期的(de)(de)25cells/ml和5cells/ml接種(zhong)濃(nong)度。準備含有參照或測試胎牛血清(qing)的(de)(de)RPM1640培(pei)養(yang)基(ji)(ji)(ji)。將(jiang)這(zhe)種(zhong)密度的(de)(de)細胞分配到(dao)各個分析生長培(pei)養(yang)基(ji)(ji)(ji)體積為0.2毫(hao)升(sheng)的(de)(de)孔(kong)中，使其分別平均含有5個和1個細胞。

3．將96孔板(ban)放入36±2℃，4-6% CO 2 的潮濕培(pei)養(yang)箱孵育約1015天。

4．在孵(fu)育期間(jian)，用肉(rou)眼觀(guan)察平(ping)板并對用于(yu)克隆的孔(kong)進行計(ji)數。克隆效率按下(xia)列方法(fa)計(ji)算：克隆效率=(陽性孔(kong)平(ping)均數/孵(fu)育孔(kong)總數)×100%

5．每(mei)一批(pi)次胎牛血(xue)(xue)(xue)清(qing)維持(chi)指(zhi)示劑骨髓瘤(liu)細(xi)胞(bao)(bao)克(ke)隆(long)(long)(long)效(xiao)(xiao)(xiao)率(lv)(lv)的定量(liang)按照(zhao)以下方法測得的相對克(ke)隆(long)(long)(long)效(xiao)(xiao)(xiao)率(lv)(lv)(RCE)進行(xing)歸一化(hua)：RCE=檢測血(xue)(xue)(xue)清(qing)的克(ke)隆(long)(long)(long)效(xiao)(xiao)(xiao)率(lv)(lv)/對照(zhao)血(xue)(xue)(xue)清(qing)的克(ke)隆(long)(long)(long)效(xiao)(xiao)(xiao)率(lv)(lv)貼壁效(xiao)(xiao)(xiao)率(lv)(lv)分(fen)析(xi)：貼壁效(xiao)(xiao)(xiao)率(lv)(lv)分(fen)析(xi)是利用已(yi)(yi)轉型的人(ren)(ren)類細(xi)胞(bao)(bao)系來檢測每(mei)一批(pi)血(xue)(xue)(xue)清(qing)促(cu)使持(chi)續(xu)貼附細(xi)胞(bao)(bao)系的生長能力。選擇(ze)已(yi)(yi)被驗(yan)證可以檢測貼壁效(xiao)(xiao)(xiao)率(lv)(lv)的細(xi)胞(bao)(bao)系A549(人(ren)(ren)肺腫(zhong)瘤(liu)細(xi)胞(bao)(bao)，ATCC#CCL,185)，是因為(wei)它可以區分(fen)一批(pi)血(xue)(xue)(xue)清(qing)維持(chi)細(xi)胞(bao)(bao)貼壁和繁(fan)殖(zhi)能力的細(xi)微差異。

每一(yi)批次(ci)胎(tai)牛血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)都要在兩(liang)(liang)(liang)種(zhong)血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)濃(nong)度(du)和(he)兩(liang)(liang)(liang)種(zhong)細(xi)胞(bao)接種(zhong)濃(nong)度(du)下(10%血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)和(he)100cells/孔，4%血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)和(he)200cells/孔)測(ce)試三次(ci)。在36±2℃，4-6% CO 2 的(de)潮濕培養箱孵(fu)育(yu)約1014天，對被染色的(de)細(xi)胞(bao)菌落進(jin)行(xing)計數即可得到其貼壁(bi)效(xiao)(xiao)率。將(jiang)結(jie)果除(chu)以(yi)參考的(de)對照血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)得以(yi)歸一(yi)化。通(tong)過兩(liang)(liang)(liang)種(zhong)血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)濃(nong)度(du)的(de)測(ce)試，可以(yi)驗證該批次(ci)血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)在減量和(he)標準水(shui)平下維(wei)持生長的(de)能力。為(wei)每一(yi)批次(ci)胎(tai)牛血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)提供的(de)分析證明報告中(zhong)的(de)貼壁(bi)效(xiao)(xiao)率值(zhi)(zhi)為(wei)兩(liang)(liang)(liang)次(ci)測(ce)試條件(jian)下的(de)平均值(zhi)(zhi)。

貼(tie)壁分(fen)析法：使用(yong)貼(tie)附分(fen)析檢測(ce)(ce)(ce)上述(shu)每(mei)一批測(ce)(ce)(ce)試血(xue)清。這種分(fen)析法針對每(mei)一個血(xue)清樣(yang)品使用(yong)一個6孔板(ban)(每(mei)室(shi)9.6cm 2 )，并可(ke)以對三個孔的數據進行平均處理。每(mei)一次化驗中，同時測(ce)(ce)(ce)量前期已驗證合格的一批胎(tai)牛血(xue)清，并將此測(ce)(ce)(ce)量值(zhi)作為(wei)內部(bu)參考(kao)標準。

貼(tie)附分析(xi)按下述方法(fa)進行：

1．A549細(xi)胞系用含有10%胎牛(niu)血清的(de)DMEM培養(yang)(yang)基，在36±2℃，以亞融合密(mi)度(du)下進行培養(yang)(yang)。

2．含10%(v/v)和4%(v/v)血(xue)(xue)清的(de)DMEM由分(fen)別在22.5毫升(sheng)(sheng)和24毫升(sheng)(sheng)DMEM中加(jia)入(ru)2.5毫升(sheng)(sheng)和1毫升(sheng)(sheng)胎牛血(xue)(xue)清配制而成，終有效體積為(wei)25毫升(sheng)(sheng)。將(jiang)5毫升(sheng)(sheng)含血(xue)(xue)清培(pei)養基(ji)分(fen)別加(jia)入(ru)6孔板(ban)的(de)每一(yi)個(ge)孔中。

3．A549培養細胞先經過(guo)胰(yi)蛋(dan)白酶(mei)消化，測定活細胞數，然后稀(xi)釋細胞懸(xuan)浮液2,000cells/ml。

4．將0.1毫(hao)升細胞懸浮液(ye)加(jia)入(ru)(ru)200cells/孔室中，0.05毫(hao)升懸浮液(ye)加(jia)入(ru)(ru)100cells/孔室中。平板混合后放入(ru)(ru)36±;2℃，5%CO 2 的潮濕培養箱孵育約1014天。

5．孵育后，取出平板，去除(chu)生長(chang)培養基，用(yong)亞甲基蘭-甲醇溶液對菌落進行染色。

6．計算(suan)(suan)菌(jun)落形成，然后(hou)按下(xia)述方法計算(suan)(suan)貼壁效(xiao)率：%貼壁效(xiao)率=每(mei)孔菌(jun)落平均數(shu)(shu)/每(mei)孔孵育活細(xi)胞平均數(shu)(shu)×100

7．為(wei)方便比較，將(jiang)測得(de)的(de)(de)(de)貼(tie)(tie)壁(bi)效(xiao)率數值除以(yi)每(mei)批檢(jian)測血清(qing)的(de)(de)(de)相對貼(tie)(tie)壁(bi)效(xiao)率(RPE)得(de)以(yi)歸一(yi)(yi)化：RCE=檢(jian)測血清(qing)的(de)(de)(de)貼(tie)(tie)壁(bi)效(xiao)率/參照血清(qing)的(de)(de)(de)貼(tie)(tie)壁(bi)效(xiao)率二(er)倍體成纖維(wei)細(xi)胞生(sheng)長：促進生(sheng)長分(fen)析用于(yu)檢(jian)測每(mei)一(yi)(yi)批胎(tai)牛血清(qing)維(wei)持難(nan)培養的(de)(de)(de)人(ren)二(er)倍體成纖維(wei)細(xi)胞長期生(sheng)長的(de)(de)(de)能力。

下列細胞(bao)系經認證可用于該實驗：

WI-38(人二倍體(ti)肺成纖維細胞，ATCC#CCL 75)

WI-38細胞(bao)在含5%胎牛血清的(de)(de)低密(mi)度(2X10 5 /瓶(ping))復式(shi)25-cm 2瓶(ping)中孵育(yu)，并(bing)進(jin)行為期三(san)(san)個連(lian)續7天的(de)(de)傳(chuan)(chuan)(chuan)代(dai)(dai)培(pei)養(yang)(yang)。在每一(yi)個培(pei)養(yang)(yang)期，細胞(bao)都從初始(shi)孵育(yu)密(mi)度開始(shi)傳(chuan)(chuan)(chuan)代(dai)(dai)培(pei)養(yang)(yang)。壓(ya)力分層(ceng)率、成倍繁(fan)殖數量和減量血清濃度是每批次(ci)(ci)促(cu)進(jin)難培(pei)養(yang)(yang)二倍體細胞(bao)的(de)(de)生(sheng)長血清的(de)(de)嚴格(ge)測(ce)試指標。通(tong)過連(lian)續三(san)(san)代(dai)(dai)培(pei)養(yang)(yang)以(yi)減少前一(yi)次(ci)(ci)生(sheng)長培(pei)養(yang)(yang)基的(de)(de)殘(can)留影響(xiang)，從而保證(zheng)(zheng)得(de)到檢測(ce)批促(cu)進(jin)生(sheng)長能力的(de)(de)真實結果。為每一(yi)批次(ci)(ci)胎牛血清提供的(de)(de)分析證(zheng)(zheng)明報告(gao)為第三(san)(san)次(ci)(ci)傳(chuan)(chuan)(chuan)代(dai)(dai)培(pei)養(yang)(yang)每復式(shi)培(pei)養(yang)(yang)瓶(ping)細胞(bao)數的(de)(de)平均值。將檢測(ce)值除以(yi)參考(kao)對照值得(de)以(yi)歸一(yi)化。

二倍(bei)體成纖(xian)維(wei)細(xi)(xi)胞(bao)生長分(fen)析(xi)法：培養數代WI-38人類二倍(bei)體肺成纖(xian)維(wei)細(xi)(xi)胞(bao)，計(ji)算每一代的細(xi)(xi)胞(bao)總數。此(ci)項檢測所挑選(xuan)出的胎牛血清(qing)批號能(neng)維(wei)持(chi)難以生長細(xi)(xi)胞(bao)、貼壁性細(xi)(xi)胞(bao)、正常(chang)的細(xi)(xi)胞(bao)株生長及存活。

1．準備含(han)5%檢測血清(qing)或已驗證合格的(de)參照血清(qing)生長(chang)(chang)培(pei)養基(ji)(ji)，基(ji)(ji)礎生長(chang)(chang)培(pei)養基(ji)(ji)為含(han)L-谷氨酰胺的(de)HBME：EBME(1：1)。按(an)要求，在每一次(ci)流量變化和(he)分(fen)析過程(cheng)中(zhong)進行傳代培(pei)養時需配制含(han)5%血清(qing)生長(chang)(chang)的(de)培(pei)養基(ji)(ji)。

2．在(zai)低代(dai)培養水平(ping)時(shi)，將(jiang)2X10 5 WI-38細胞加入各個含9.5毫升生(sheng)長培養基的(de)復(fu)式(shi)25-cm 2 培養基中。在(zai)不擰緊瓶蓋(gai)的(de)情況下，將(jiang)培養瓶放(fang)入4-6%CO 2， 36℃±2℃環境中，保(bao)持24小時(shi)。然后擰緊瓶蓋(gai)，將(jiang)培養瓶放(fang)在(zai)36℃±2℃下孵育7天，在(zai)第2天或第3天全部更換培養基。

3．在第7天(tian)，用胰(yi)蛋白(bai)酶(mei)對每一個含(han)參照或檢測血清的(de)復式(shi)(shi)瓶(ping)(ping)中(zhong)的(de)細(xi)胞進(jin)行消化得到一定數量細(xi)胞，然后合并并計數。將(jiang)2x10 5 WI-38細(xi)胞加入(ru)含(han)有新(xin)鮮生長(chang)培(pei)養(yang)基(ji)(已加入(ru)了與上一代(dai)同一批次的(de)參照或檢測胎牛血清)的(de)新(xin)的(de)復式(shi)(shi)25-cm 2 瓶(ping)(ping)中(zhong)，進(jin)行細(xi)胞傳代(dai)培(pei)養(yang)。按第2步所述，將(jiang)培(pei)養(yang)瓶(ping)(ping)進(jin)行平衡并孵育(yu)。

4．如上(shang)所(suo)述經(jing)過三(san)代(dai)連續分(fen)析，在每一代(dai)結(jie)束(shu)時計算每一批參(can)(can)照(zhao)或(huo)檢測(ce)血清(qing)(qing)的(de)每瓶細胞平均數。后一代(dai)培養的(de)各批檢測(ce)血清(qing)(qing)實(shi)驗中的(de)相對生長(chang)率(RGR)作為參(can)(can)照(zhao)血清(qing)(qing)實(shi)驗中獲得的(de)細胞生長(chang)率分(fen)子：

%RGR=檢測(ce)血清實(shi)驗中每瓶平均細胞數/參照血清實(shi)驗中每瓶平均細胞數X100S f9細胞生(sheng)長(chang)(chang)促進分(fen)(fen)析(xi)。通過昆蟲分(fen)(fen)析(xi)可(ke)(ke)以保(bao)證(zheng)您購買(mai)的(de)胎牛血清批次可(ke)(ke)以維持S f9細胞的(de)生(sheng)長(chang)(chang)。收到產(chan)品后，您需要(yao)做的(de)就是混勻血清，在56℃下熱滅活(huo)30分(fen)(fen)鐘。這種分(fen)(fen)析(xi)法也(ye)可(ke)(ke)以用(yong)于(yu)乳(ru)白(bai)蛋白(bai)水解產(chan)品、酵母和其它生(sheng)長(chang)(chang)輔料作為原料的(de)生(sheng)物(wu)效能分(fen)(fen)析(xi)。該分(fen)(fen)析(xi)法的(de)準確性取決于(yu)是否用(yong)常(chang)規的(de)細胞培養方案進行培養。用(yong)臺盼(pan)藍染(ran)色排除法測(ce)得(de)的(de)細胞活(huo)性少不低(di)于(yu)80%。

細胞生長分析法。

1．使用含10%檢測或(huo)參照熱滅活(huo)胎牛血清的(de)已驗證的(de)Grace昆明培(pei)養基配制*檢測培(pei)養基。

2．將(jiang)儲備Sf9細胞加(jia)入(ru)50毫升離心管(guan)中，在(zai)50Xg下(xia)離心5分鐘。然后(hou)將(jiang)每(mei)支(zhi)試管(guan)的沉淀物重(zhong)新(xin)用含10%的檢測或參照熱滅活胎牛(niu)血清*培養基配(pei)制成懸浮(fu)液。

3．反(fan)試管(guan)顛倒(dao)幾次，然后每支試管(guan)倒(dao)出1毫(hao)升樣品。用臺盼藍染色排除進行活細(xi)胞計(ji)數。

4．如果活(huo)性≥80%，把試(shi)管再顛(dian)倒幾次并取出0.25毫升樣品。然后用Coulter計數器進行細胞計數。

5．將(jiang)細胞加入Erlenmeyer瓶中(zhong)，使其(qi)終細胞濃度為(wei)2.75X10 5 cells/ml。孵(fu)育后，再一次進行細胞計數(shu)，以保(bao)證細胞密度為(wei)2.5X10 5 3.0X10 5 cells/ml。

6．將培養(yang)瓶放到搖床上，在27℃±1℃、80-90rpm條件下孵育96小時(shi)。

7．從每一(yi)培養瓶中分(fen)別取(qu)出(chu)0.25毫升樣品，用Coulter計數(shu)器進行(xing)計數(shu)。同時(shi)取(qu)出(chu)一(yi)定量的樣品進行(xing)細(xi)胞活性檢測(ce)。

8．將檢測細(xi)(xi)胞密(mi)度與(yu)參照細(xi)(xi)胞密(mi)度相(xiang)比即可得到相(xiang)對(dui)細(xi)(xi)胞密(mi)度(RCN)。

噬菌(jun)(jun)體檢測(ce):我們利用溶(rong)菌(jun)(jun)斑(ban)分(fen)析法(fa)來檢測(ce)是(shi)否存在(zai)噬菌(jun)(jun)體。從每一(yi)批血清中(zhong)取具代表性的(de)樣品加入(ru)胰蛋白酶磷(lin)酸(suan)瓊(qiong)脂中(zhong)，并在(zai)其加入(ru)含有噬菌(jun)(jun)體敏感的(de)大腸桿菌(jun)(jun)懸浮液(C-3000或K-12)。然后，混合物會在(zai)胰蛋白酶磷(lin)酸(suan)瓊(qiong)脂平板上(shang)(shang)分(fen)層(ceng)，在(zai)36±2℃環境下(xia)孵育(yu)約24小(xiao)時后，觀察平板上(shang)(shang)溶(rong)菌(jun)(jun)斑(ban)的(de)形態。

生化特征檢測。

四季青(qing) 無噬菌體，低(di)內(nei)毒素特(te)級胎牛血清檢測(ce)：所有批次的(de)胎牛血(xue)清我們都進行了(le)血(xue)紅蛋(dan)白的(de)檢測(ce)，血(xue)紅蛋(dan)白含量(liang)低于《中(zhong)國生物制品(pin)主要原輔材料(liao)指(zhi)控指(zhi)標》(2000年(nian)版)公(gong)布的(de)指(zhi)標。

效能檢測：其它血清

新(xin)生(sheng)(sheng)牛(niu)血(xue)清。檢測新(xin)生(sheng)(sheng)牛(niu)血(xue)清維(wei)持超過三(san)代VERO細(xi)胞生(sheng)(sheng)長(chang)(chang)的(de)(de)能力。在每一個培養期(qi)，細(xi)胞都從初始孵(fu)育密度開始傳代培養。可將所得結(jie)果(guo)與(yu)使用含有已知特征(zheng)的(de)(de)參照血(xue)清對照生(sheng)(sheng)長(chang)(chang)培養基獲得的(de)(de)平行結(jie)果(guo)進行比較(jiao)。

馬(ma)血(xue)清。每一批馬(ma)血(xue)清被(bei)檢(jian)測(ce)維(wei)持在含有檢(jian)測(ce)批血(xue)清的對(dui)照培養(yang)基上Sp2/0-Ag14(小鼠(shu)骨髓瘤)細胞生長的能力。可(ke)將所得結果與使(shi)用含有已(yi)知特征的參照血(xue)清對(dui)照生長培養(yang)基獲(huo)得的平行(xing)結果進行(xing)比較。

血(xue)(xue)清的(de)使用與儲存(cun)：正確的(de)使用及保存(cun)血(xue)(xue)清，才(cai)能使血(xue)(xue)清發揮應有(you)的(de)作用。

1. 儲(chu)(chu)存條件：血(xue)清一般儲(chu)(chu)存于(yu)－20℃，同時(shi)應(ying)避免反(fan)復凍融。購(gou)買大包裝(zhuang)的血(xue)清后，先要滅活處理，然后分裝(zhuang)成小包裝(zhuang)，儲(chu)(chu)存于(yu)－20℃，使用(yong)前融化(hua)。融化(hua)時(shi)好(hao)先置(zhi)于(yu)4℃。融化(hua)后的血(xue)清在4℃不宜(yi)長時(shi)間存放，應(ying)盡快(kuai)使用(yong)。

2. 使(shi)用(yong)濃(nong)度：自(zi)從有了合成培養(yang)基，血清(qing)(qing)就是作為(wei)一種添加成分與合成培養(yang)基混合使(shi)用(yong)，使(shi)用(yong)濃(nong)度一般為(wei)5－20％，常用(yong)是10％。過多血清(qing)(qing)容(rong)易使(shi)培養(yang)中(zhong)的(de)細(xi)胞發生(sheng)(sheng)變化，特別是一些(xie)二倍體的(de)無限細(xi)胞系，迅(xun)速生(sheng)(sheng)長之后容(rong)易發生(sheng)(sheng)惡性轉化。

關于使用中的常見問題

1.保存血清好的辦法？
我們建議血(xue)清(qing)應保存在-5℃-20℃。若你一(yi)次無法用完一(yi)瓶，建議您無菌(jun)分裝血(xue)清(qing)恰當的滅菌(jun)容器內，再放回冷凍。

2.如何解凍血清才不會使產品質量受損？
我們建議(yi)您將血清從冷凍箱中(zhong)(zhong)取(qu)出后(hou)，先置于2-8℃冰箱中(zhong)(zhong)使之(zhi)溶(rong)解(jie)，然(ran)后(hou)在室溫下使之(zhi)全溶(rong)。但必(bi)須注意的是(shi)，溶(rong)解(jie)過程(cheng)中(zhong)(zhong)必(bi)須規則(ze)地搖晃(huang)均勻。

3.血清解凍后發現有絮狀沉淀物出現，該如何處理？
血清中沉淀物的出現有許多原因，但普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性造成的；而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解凍后，也會存在于血清中，亦是造成血清沉淀物的主要原因之一。但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質量。

若您欲去除這些(xie)絮狀(zhuang)沉淀物，可以(yi)將(jiang)血(xue)清分(fen)裝無菌離(li)心管中(zhong)，以(yi)400g稍微離(li)心，上(shang)清液即可接著(zhu)加入培養基(ji)內一起過濾。我們不建議(yi)您以(yi)過濾的方法去除這些(xie)絮狀(zhuang)沉淀物，因為(wei)它可能會(hui)阻塞您的過濾膜。

4.何謂熱滅活？有必要做熱滅活嗎？
一般以56℃，30分鐘水浴來處理已解凍的血清，因為此加熱步驟，可以使補體去活性，而補體所參與的反應有：溶細胞活性，平滑肌的收縮，肥大細胞和血小板組胺的釋放，增強吞噬作用，淋巴細胞、巨噬細胞的趨化和激活。實驗顯示，經過正確處理的熱滅活血清，對大多數的細胞而言是不需要的。經過處理的血清對細胞生長只有微小的促進，或*沒有任何作用，甚通常因為高溫處理影響了血清的質量，而造成細胞生長速率的降低。

而經過熱處理的(de)血清(qing)，沉(chen)淀(dian)物(wu)的(de)形成會(hui)(hui)顯著的(de)增(zeng)多，這些沉(chen)淀(dian)物(wu)在(zai)倒置顯微(wei)鏡下觀察，像是“小(xiao)黑點"，常常會(hui)(hui)讓研究者(zhe)(zhe)誤以為是血清(qing)遭受污染，而把血清(qing)放在(zai)37℃環境中，又會(hui)(hui)使此沉(chen)淀(dian)物(wu)更增(zeng)多，使研究者(zhe)(zhe)認為是微(wei)生物(wu)的(de)分裂(lie)擴(kuo)增(zeng)。因此我們建(jian)議您(nin)(nin)，若非(fei)必(bi)須(xu)，您(nin)(nin)可(ke)以不(bu)需要做熱滅(mie)活這一(yi)步。如此以來，不(bu)但(dan)節省您(nin)(nin)寶貴的(de)時間，更確保您(nin)(nin)血清(qing)的(de)質量！

5.如何避免沉淀物的出現？
我們建(jian)議您在使用血(xue)清(qing)(qing)的時(shi)候，注意(yi)正(zheng)確的血(xue)清(qing)(qing)解(jie)凍(dong)步驟(zou)，并盡量避免滅活血(xue)清(qing)(qing)及(ji)長時(shi)間的將血(xue)清(qing)(qing)置于高溫(wen)環境中(zhong)。

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