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標準胎牛血(xue)清

血(xue)清(qing)通常作為補充成(cheng)分添加(jia)在(zai)基(ji)礎培(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)內(nei)使用。它能夠提(ti)供各(ge)種大分子蛋白，小(xiao)分子量營養(yang)(yang)，水溶性成(cheng)分的轉(zhuan)運蛋白，和其它一(yi)些細(xi)胞(bao)在(zai)體外(wai)所必需的成(cheng)分，如激素和附著因子。血(xue)清(qing)可以結(jie)合或中(zhong)和一(yi)些生長因子中(zhong)的有毒成(cheng)分，并提(ti)供培(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)的緩沖能力。細(xi)胞(bao)培(pei)(pei)養(yang)(yang)時血(xue)清(qing)的添加(jia)依賴(lai)于基(ji)礎培(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)的化(hua)學組成(cheng)，培(pei)(pei)養(yang)(yang)細(xi)胞(bao)的類型，及所用的培(pei)(pei)養(yang)(yang)系統。

我們(men)在提供(gong)細胞培養基(ji)、平衡鹽溶液(ye)、無血(xue)清培養基(ji)和(he)試(shi)劑的(de)(de)同(tong)時，還(huan)提供(gong)高(gao)品質的(de)(de)血(xue)清。我們(men)對血(xue)清制備(bei)進行全過程監管(guan)。從(cong)血(xue)清收集到(dao)終(zhong)產(chan)品檢驗和(he)內部稽核的(de)(de)每一個步驟，我們(men)都采(cai)用設備(bei)和(he)標準操作程序，以確(que)保(bao)整個過程中每個環節的(de)(de)產(chan)品質量。對整個過程的(de)(de)控制可以保(bao)證(zheng)產(chan)品的(de)(de)持續高(gao)品質，降低不(bu)同(tong)批次的(de)(de)差異(yi)。

處理：全部血清(qing)：收集的(de)血液均在(zai)冷(leng)藏條件下(xia)處理。血清(qing)和(he)血塊(kuai)分離(li)后立(li)即將血清(qing)合并(bing)并(bing)冷(leng)凍(dong)。只有(you)符合我們的(de)檢測標準的(de)血清(qing)才(cai)被接受作進一步處理。

熱(re)滅(mie)(mie)活血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)：熱(re)滅(mie)(mie)活是在56℃水浴中(zhong)嚴(yan)格控(kong)溫30分鐘。透(tou)析血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)：用(yong)10,000截(jie)留分子量(liang)(liang)的(de)(de)(de)(de)透(tou)析膜(mo)在0.15M的(de)(de)(de)(de)NaCl中(zhong)進(jin)(jin)行透(tou)析，直到(dao)葡萄(tao)糖水平低(di)于(yu)5mg/dl(用(yong)鄰甲(jia)苯胺測試法檢驗)。γ射(she)(she)線照(zhao)(zhao)射(she)(she)血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)：可按客(ke)戶要求對血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)進(jin)(jin)行γ射(she)(she)線照(zhao)(zhao)射(she)(she)。通過(guo)(guo)(guo)γ射(she)(she)線照(zhao)(zhao)射(she)(she)以滅(mie)(mie)活各種動物(wu)血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(包括(kuo)(kuo)胎牛血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)、新生(sheng)牛血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)、豬血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)和(he)馬血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing))中(zhong)的(de)(de)(de)(de)病毒和(he)支(zhi)原體(ti)的(de)(de)(de)(de)方法已經得到(dao)證實。研(yan)究(jiu)證實照(zhao)(zhao)射(she)(she)劑(ji)量(liang)(liang)在30-45kGy為宜。血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)在此照(zhao)(zhao)射(she)(she)后(hou)物(wu)理(li)化學特性和(he)細(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)表現(xian)沒有變化。裝瓶：粗血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)須(xu)通過(guo)(guo)(guo)一系列的(de)(de)(de)(de)過(guo)(guo)(guo)濾(lv)才成為成品。后(hou)的(de)(de)(de)(de)過(guo)(guo)(guo)濾(lv)步(bu)驟包括(kuo)(kuo)使用(yong)0.2um和(he)0.1um的(de)(de)(de)(de)無菌過(guo)(guo)(guo)濾(lv)。胎牛血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)須(xu)通過(guo)(guo)(guo)三次0.1um過(guo)(guo)(guo)濾(lv)，其(qi)他血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)須(xu)通過(guo)(guo)(guo)0.2um過(guo)(guo)(guo)濾(lv)。終(zhong)產品的(de)(de)(de)(de)質量(liang)(liang)控(kong)制(zhi)：我們采取以下方法對每一批次的(de)(de)(de)(de)產品選取一定數量(liang)(liang)的(de)(de)(de)(de)樣品進(jin)(jin)行質量(liang)(liang)控(kong)制(zhi)分析：

化學檢(jian)測：使用(yong)低溫凝固點的(de)方法檢(jian)測滲(shen)透壓，以保證符合產品規(gui)范。我(wo)們每天(tian)使用(yong)國家標(biao)(biao)(biao)準(zhun)的(de)技(ji)術(shu)(shu)研究所(suo)標(biao)(biao)(biao)定(ding)的(de)標(biao)(biao)(biao)準(zhun)溶(rong)液(ye)對(dui)我(wo)們的(de)滲(shen)透壓檢(jian)測儀器進行校準(zhun)。同樣每天(tian)使用(yong)國家標(biao)(biao)(biao)準(zhun)技(ji)術(shu)(shu)研究所(suo)標(biao)(biao)(biao)定(ding)的(de)標(biao)(biao)(biao)準(zhun)溶(rong)液(ye)對(dui)pH計進行校準(zhun)。

使用(yong)電泳(yong)圖譜鑒定血清的(de)整體(ti)性質。樣(yang)品被轉移到(dao)硝酸纖維素基質中(zhong)，并在(zai)緩沖體(ti)系內遷移。條(tiao)帶經染色、清潔(jie)、干(gan)燥后用(yong)密度(du)儀進(jin)行掃描，以檢測白(bai)蛋白(bai)和球蛋白(bai)組分的(de)相對濃度(du)。為(wei)證實(shi)是否在(zai)適當(dang)的(de)條(tiao)件(jian)下進(jin)行采血和處理，使用(yong)修飾的(de)Fleming方法對血紅蛋白(bai)進(jin)行分光(guang)光(guang)度(du)檢測。

隨著動(dong)(dong)物(wu)年齡的增加，血(xue)清總(zong)蛋(dan)(dan)白(bai)含量也(ye)相應地提高。使用(yong)自動(dong)(dong)化的Biuret方法進行總(zong)血(xue)清蛋(dan)(dan)白(bai)的檢測，以確認動(dong)(dong)物(wu)年齡并驗證符合產品(pin)規范。使用(yong)色(se)度(du)計在不同波長下檢測樣品(pin)和Biuret試(shi)劑(ji)混合波的吸光度(du)。自動(dong)(dong)計算結果后，與標(biao)準(zhun)曲線(xian)比較(jiao)，即可得(de)到蛋(dan)(dan)白(bai)值(克/公升)。

穩定性檢測程序：在每一個(ge)標記為體外診(zhen)斷的(de)產(chan)品上顯(xian)示的(de)效(xiao)期(qi)表明了這個(ge)產(chan)品具有(you)多長時(shi)間的(de)效(xiao)能。我們的(de)穩定性程序確定和證明了產(chan)品效(xiao)期(qi)。我們定期(qi)監測批量產(chan)品，確定產(chan)品在推(tui)薦貯存(cun)條件下具有(you)可接受(shou)效(xiao)果的(de)時(shi)間長度。

微(wei)生(sheng)物學檢(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)：所有(you)血清(qing)使用Barile&Kern的(de)(de)大體積方(fang)法(fa)(fa)檢(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)支原(yuan)(yuan)體。在(zai)推薦方(fang)法(fa)(fa)的(de)(de)檢(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)范(fan)圍內(nei)(nei)檢(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)結果是準確的(de)(de)。樣品(pin)少(shao)應該在(zai)肉(rou)湯(tang)中(zhong)合并培(pei)養3個星期，同時要在(zai)瓊脂(zhi)平板(ban)上進行(xing)不少(shao)于(yu)4次傳(chuan)代培(pei)養。在(zai)有(you)氧和(he)厭氧(95%氮，5%CO2)條件下(xia)，平板(ban)在(zai)36±2℃下(xia)孵(fu)育(yu)。在(zai)檢(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)過(guo)程中(zhong)，每周對(dui)瓊脂(zhi)平板(ban)進行(xing)一次微(wei)生(sheng)物生(sheng)長情況檢(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)驗。使用Dienes染色法(fa)(fa)對(dui)懷疑被污染的(de)(de)瓊脂(zhi)平板(ban)進行(xing)支原(yuan)(yuan)體菌落的(de)(de)檢(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)。然后，對(dui)平板(ban)進行(xing)再次鏡檢(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)。對(dui)孵(fu)育(yu)肉(rou)湯(tang)瓶要定期進行(xing)濁度和(he)pH值變動(dong)的(de)(de)檢(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)。在(zai)推薦方(fang)法(fa)(fa)檢(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)范(fan)圍內(nei)(nei)，所有(you)血清(qing)也要使用Hoechst熒光DNA染色法(fa)(fa)進行(xing)不可在(zai)肉(rou)湯(tang)中(zhong)培(pei)養的(de)(de)支原(yuan)(yuan)體(包括M.hyorhinis屬(shu))檢(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)。

病毒(du)檢(jian)測(ce)(ce)：已(yi)知(zhi)無外來物(wu)質的(de)細(xi)胞(bao)培(pei)(pei)(pei)養基須(xu)經過(guo)在(zai)包含15%測(ce)(ce)試血清(qing)的(de)生長(chang)培(pei)(pei)(pei)養基中進(jin)行(xing)為(wei)期21天(tian)的(de)三次(ci)傳代培(pei)(pei)(pei)養。使(shi)用對照(zhao)培(pei)(pei)(pei)養基和已(yi)知(zhi)對外來物(wu)質為(wei)陰(yin)性的(de)血清(qing)平(ping)行(xing)地維(wei)持陰(yin)性對照(zhao)培(pei)(pei)(pei)養。整個(ge)期間，檢(jian)測(ce)(ce)所有的(de)培(pei)(pei)(pei)養情況，以(yi)便(bian)發現(xian)是否(fou)存在(zai)病毒(du)誘發的(de)細(xi)胞(bao)形態改(gai)變或致細(xi)胞(bao)病變效應。在(zai)1421天(tian)的(de)培(pei)(pei)(pei)養期間，對含有檢(jian)測(ce)(ce)血清(qing)的(de)平(ping)行(xing)培(pei)(pei)(pei)養瓶按下面標(biao)準病毒(du)檢(jian)測(ce)(ce)方法進(jin)行(xing)評估。

將其中一瓶檢測細(xi)胞(bao)用(yong)胰(yi)蛋白酶(mei)消化，然(ran)后(hou)把細(xi)胞(bao)分別加入到總面積為(wei)6cm 2 的(de)六(liu)室載玻片(pian)上(shang)。同(tong)時準備陰性(xing)對照(zhao)載玻片(pian)。在檢測培(pei)養(yang)(yang)的(de)單(dan)室載玻片(pian)上(shang)加入牛病(bing)毒性(xing)腹瀉(xie)病(bing)毒(BVDV)、牛細(xi)小(xiao)病(bing)毒、牛腺病(bing)毒、狂(kuang)犬病(bing)毒和呼腸病(bing)毒的(de)染(ran)色劑，作為(wei)單(dan)個的(de)陽性(xing)對照(zhao)。再經過7天培(pei)養(yang)(yang)(總共(gong)21天)，利(li)用(yong)熒光抗體技術(shu)檢測病(bing)毒。

通過(guo)對檢測(ce)培養(yang)進行蘇木精伊紅染(ran)色，觀察致細胞(bao)突變效(xiao)應(ying)(CPE)或其(qi)他病毒(du)誘(you)導效(xiao)應(ying)。檢測(ce)細胞(bao)是(shi)否存在(zai)CPE效(xiao)應(ying)、內含(han)物、多核體(ti)或其(qi)他異常效(xiao)應(ying)。

內毒素檢測：我們用阿米巴變形細胞溶解物(LAL)凝(ning)膠法來檢測胎牛(niu)血清的內毒素含量。

效能檢測：
對每一批次(ci)的(de)(de)胎牛(niu)血清(qing)，我(wo)們(men)都進行下述培(pei)養效(xiao)能(neng)檢(jian)測。選擇(ze)血清(qing)重(zhong)要的(de)(de)標(biao)準是其支持特殊細(xi)胞的(de)(de)生長(chang)能(neng)力(li)。因(yin)此，除了保證血清(qing)通過嚴格的(de)(de)品質控制(zhi)，我(wo)們(men)也同時在實驗室(shi)條(tiao)件下對血清(qing)的(de)(de)三個重(zhong)要的(de)(de)培(pei)養效(xiao)能(neng)進行檢(jian)測：克(ke)隆效(xiao)率、貼壁效(xiao)果和二(er)倍體(ti)成纖維(wei)細(xi)胞生長(chang)促進。

克隆效率分析：克隆效率實驗分析每一批胎牛血清促進小鼠骨髓瘤細胞及其衍生的雜交瘤細胞的克隆和生長能力。下列產品
經驗證可用于該實驗：
Sp2/0-Ag14(ATCC #CRL 1581)
P3x63-Ag8.653(ATCC #CRL 1580)

每一批(pi)胎牛(niu)血(xue)(xue)清都(dou)要分別在(zai)復制微量滴定平(ping)板上加入兩種血(xue)(xue)清濃度和(he)(he)兩種細胞(bao)接種量(10%血(xue)(xue)清和(he)(he)1cell/孔，4%血(xue)(xue)清和(he)(he)5cells/孔)的(de)(de)(de)情況下進(jin)行分析(xi)。克(ke)隆分析(xi)結果除(chu)以(yi)已確定的(de)(de)(de)參照血(xue)(xue)清值得以(yi)歸一化。在(zai)許(xu)多日常雜交(jiao)選擇(ze)程序中具有代表(biao)性的(de)(de)(de)是高(gao)濃度的(de)(de)(de)血(xue)(xue)清，而(er)低濃度血(xue)(xue)清在(zai)設計血(xue)(xue)清批(pi)次細微差(cha)異放大檢測中有更(geng)為(wei)嚴格的(de)(de)(de)測試。嚴格的(de)(de)(de)1cell/孔測試是模擬(ni)單一雜交(jiao)選擇(ze)的(de)(de)(de)實(shi)驗室條件(jian)。為(wei)每一批(pi)次胎牛(niu)血(xue)(xue)清提供的(de)(de)(de)分析(xi)證明報告中的(de)(de)(de)克(ke)隆效率值為(wei)兩次測試條件(jian)下的(de)(de)(de)平(ping)均值。

克隆分析法：克隆分析法是在復式96孔板中加入兩種胎牛血清濃度(10%v/v)和(4%v/v)和兩種接種量的情況下進行的。每一次化驗中，同時測量前期已驗證合格的一批胎牛血清，并將此測量值作為內部參考標準。
克隆分析按下述方法進行：

1．Sp2/0-Ag14(sp2)和(he)P3x63-Ag8.653(653)在含(han)有10%的(de)胎(tai)牛血清的(de)RPM1640中通常保持(chi)對數生長(chang)期。在顯(xian)微鏡下，利用臺盼藍排(pai)除(chu)法(fa)對活細胞進行(xing)計數。

2．用RPM1640培養(yang)基將(jiang)儲備(bei)(bei)細胞懸浮液進行連續稀釋，使其(qi)(qi)達到預期的25cells/ml和5cells/ml接(jie)種濃度。準備(bei)(bei)含有(you)參照或(huo)測試(shi)胎牛血清的RPM1640培養(yang)基。將(jiang)這(zhe)種密度的細胞分配到各個分析生長培養(yang)基體積為0.2毫升的孔中，使其(qi)(qi)分別平(ping)均含有(you)5個和1個細胞。

3．將96孔板(ban)放入(ru)36±2℃，4-6% CO 2 的潮濕培養箱(xiang)孵育(yu)約1015天。

4．在孵育期間，用肉眼觀察平板(ban)并對(dui)用于克(ke)隆的(de)孔(kong)進(jin)行計數。克(ke)隆效(xiao)率按(an)下列方法計算：克(ke)隆效(xiao)率=(陽性孔(kong)平均數/孵育孔(kong)總數)×100%

5．每一批次胎牛(niu)血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)維(wei)持(chi)指示劑骨髓瘤(liu)細胞(bao)克(ke)隆(long)(long)效率的定量按照(zhao)以下方法測(ce)得的相對(dui)克(ke)隆(long)(long)效率(RCE)進行歸(gui)一化：RCE=檢測(ce)血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)的克(ke)隆(long)(long)效率/對(dui)照(zhao)血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)的克(ke)隆(long)(long)效率貼(tie)(tie)壁(bi)(bi)(bi)效率分析：貼(tie)(tie)壁(bi)(bi)(bi)效率分析是利(li)用已轉型的人類(lei)細胞(bao)系來檢測(ce)每一批血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)促(cu)使(shi)持(chi)續貼(tie)(tie)附細胞(bao)系的生長能力。選擇已被驗證可以檢測(ce)貼(tie)(tie)壁(bi)(bi)(bi)效率的細胞(bao)系A549(人肺腫瘤(liu)細胞(bao)，ATCC#CCL,185)，是因(yin)為(wei)它可以區分一批血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)維(wei)持(chi)細胞(bao)貼(tie)(tie)壁(bi)(bi)(bi)和(he)繁(fan)殖能力的細微差(cha)異(yi)。

每一(yi)批次胎牛(niu)血(xue)(xue)清(qing)都要在兩(liang)(liang)種(zhong)(zhong)血(xue)(xue)清(qing)濃度和(he)(he)兩(liang)(liang)種(zhong)(zhong)細胞接種(zhong)(zhong)濃度下(10%血(xue)(xue)清(qing)和(he)(he)100cells/孔，4%血(xue)(xue)清(qing)和(he)(he)200cells/孔)測(ce)試三次。在36±2℃，4-6% CO 2 的潮濕培養箱(xiang)孵育約1014天(tian)，對被染色的細胞菌落進行計數即可(ke)(ke)得(de)到(dao)其貼壁效(xiao)率(lv)。將結果(guo)除以參考的對照血(xue)(xue)清(qing)得(de)以歸一(yi)化(hua)。通過兩(liang)(liang)種(zhong)(zhong)血(xue)(xue)清(qing)濃度的測(ce)試，可(ke)(ke)以驗證該批次血(xue)(xue)清(qing)在減量和(he)(he)標(biao)準水(shui)平下維持生長的能(neng)力。為每一(yi)批次胎牛(niu)血(xue)(xue)清(qing)提供的分析證明報告中的貼壁效(xiao)率(lv)值(zhi)為兩(liang)(liang)次測(ce)試條件下的平均值(zhi)。

貼壁分析(xi)(xi)法：使用貼附分析(xi)(xi)檢測(ce)上述每(mei)一(yi)(yi)批(pi)測(ce)試血清(qing)。這種(zhong)分析(xi)(xi)法針對(dui)(dui)每(mei)一(yi)(yi)個(ge)血清(qing)樣品使用一(yi)(yi)個(ge)6孔(kong)板(每(mei)室9.6cm 2 )，并可(ke)以對(dui)(dui)三個(ge)孔(kong)的數據進行平均處理。每(mei)一(yi)(yi)次化(hua)驗(yan)中(zhong)，同時測(ce)量(liang)前期(qi)已驗(yan)證(zheng)合格的一(yi)(yi)批(pi)胎牛(niu)血清(qing)，并將此測(ce)量(liang)值作為內部參考標準。

貼(tie)附分析按下述方法進(jin)行：

1．A549細胞系(xi)用含有10%胎(tai)牛血清的DMEM培養(yang)基，在36±2℃，以亞(ya)融合密度下進(jin)行培養(yang)。

2．含10%(v/v)和(he)(he)4%(v/v)血清(qing)(qing)(qing)的DMEM由分別(bie)在22.5毫升(sheng)和(he)(he)24毫升(sheng)DMEM中(zhong)加入(ru)(ru)2.5毫升(sheng)和(he)(he)1毫升(sheng)胎牛血清(qing)(qing)(qing)配制而成，終(zhong)有效體積為25毫升(sheng)。將5毫升(sheng)含血清(qing)(qing)(qing)培養基分別(bie)加入(ru)(ru)6孔(kong)板(ban)的每一個(ge)孔(kong)中(zhong)。

3．A549培養細胞(bao)(bao)先經過胰蛋白酶消化，測定活(huo)細胞(bao)(bao)數，然后(hou)稀釋細胞(bao)(bao)懸(xuan)浮液(ye)2,000cells/ml。

4．將0.1毫升細胞懸(xuan)浮液(ye)加入(ru)200cells/孔室(shi)中，0.05毫升懸(xuan)浮液(ye)加入(ru)100cells/孔室(shi)中。平板混合后(hou)放入(ru)36±2℃，5%CO 2 的潮濕培養箱(xiang)孵(fu)育約1014天。

5．孵育后，取(qu)出平(ping)板(ban)，去除生長培養基，用(yong)亞甲(jia)基蘭(lan)-甲(jia)醇(chun)溶液對菌落進行染色。

6．計(ji)算(suan)菌(jun)落(luo)形(xing)成，然后按下(xia)述方法計(ji)算(suan)貼壁(bi)(bi)效(xiao)率：%貼壁(bi)(bi)效(xiao)率=每孔(kong)菌(jun)落(luo)平均數/每孔(kong)孵育活細胞平均數×100

7．為方便比(bi)較(jiao)，將測得的(de)貼(tie)壁(bi)效率數值除(chu)以每批檢(jian)(jian)測血(xue)清(qing)的(de)相對貼(tie)壁(bi)效率(RPE)得以歸一化：RCE=檢(jian)(jian)測血(xue)清(qing)的(de)貼(tie)壁(bi)效率/參照(zhao)血(xue)清(qing)的(de)貼(tie)壁(bi)效率二(er)倍(bei)體成纖維細胞生長(chang)：促進生長(chang)分析用于(yu)檢(jian)(jian)測每一批胎牛血(xue)清(qing)維持難培養的(de)人二(er)倍(bei)體成纖維細胞長(chang)期生長(chang)的(de)能(neng)力。

下列細(xi)胞系經(jing)認證可用于該實驗：

WI-38(人二倍體(ti)肺成纖(xian)維細(xi)胞，ATCC#CCL 75)

WI-38細(xi)(xi)胞(bao)在含5%胎(tai)(tai)牛血清的(de)(de)低(di)密(mi)度(2X10 5 /瓶(ping)(ping))復式(shi)25-cm 2瓶(ping)(ping)中(zhong)孵(fu)育(yu)，并進行(xing)為(wei)(wei)期三個連續7天的(de)(de)傳(chuan)代培(pei)(pei)養(yang)(yang)。在每(mei)一(yi)個培(pei)(pei)養(yang)(yang)期，細(xi)(xi)胞(bao)都從(cong)初始孵(fu)育(yu)密(mi)度開始傳(chuan)代培(pei)(pei)養(yang)(yang)。壓力(li)分層率、成倍(bei)繁殖數量和減(jian)量血清濃度是每(mei)批(pi)次促進難培(pei)(pei)養(yang)(yang)二倍(bei)體細(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)生(sheng)長血清的(de)(de)嚴格測(ce)試指(zhi)標。通過連續三代培(pei)(pei)養(yang)(yang)以(yi)減(jian)少前(qian)一(yi)次生(sheng)長培(pei)(pei)養(yang)(yang)基的(de)(de)殘留影響(xiang)，從(cong)而保證(zheng)得到檢測(ce)批(pi)促進生(sheng)長能力(li)的(de)(de)真實結果。為(wei)(wei)每(mei)一(yi)批(pi)次胎(tai)(tai)牛血清提供的(de)(de)分析證(zheng)明報告為(wei)(wei)第三次傳(chuan)代培(pei)(pei)養(yang)(yang)每(mei)復式(shi)培(pei)(pei)養(yang)(yang)瓶(ping)(ping)細(xi)(xi)胞(bao)數的(de)(de)平均值(zhi)。將(jiang)檢測(ce)值(zhi)除以(yi)參考對照值(zhi)得以(yi)歸一(yi)化(hua)。

二倍體(ti)成纖維(wei)(wei)細(xi)胞(bao)生(sheng)長分析法：培(pei)養數(shu)代(dai)WI-38人(ren)類二倍體(ti)肺成纖維(wei)(wei)細(xi)胞(bao)，計算每(mei)一(yi)代(dai)的(de)細(xi)胞(bao)總(zong)數(shu)。此項檢測所挑選(xuan)出的(de)胎(tai)牛血(xue)清(qing)批號(hao)能維(wei)(wei)持難以生(sheng)長細(xi)胞(bao)、貼壁性細(xi)胞(bao)、正常的(de)細(xi)胞(bao)株(zhu)生(sheng)長及存活(huo)。

1．準(zhun)備含5%檢測血(xue)清或已驗(yan)證合格的(de)參照血(xue)清生長培(pei)養(yang)基(ji)，基(ji)礎生長培(pei)養(yang)基(ji)為含L-谷氨酰胺的(de)HBME：EBME(1：1)。按要求，在(zai)每一次流量變化和分析過程(cheng)中進(jin)行傳代培(pei)養(yang)時需(xu)配制含5%血(xue)清生長的(de)培(pei)養(yang)基(ji)。

2．在(zai)(zai)(zai)低代(dai)培(pei)(pei)養(yang)(yang)水平時，將(jiang)2X10 5 WI-38細胞加(jia)入各(ge)個含9.5毫升生長培(pei)(pei)養(yang)(yang)基的(de)復式25-cm 2 培(pei)(pei)養(yang)(yang)基中。在(zai)(zai)(zai)不擰緊瓶蓋(gai)的(de)情況下(xia)，將(jiang)培(pei)(pei)養(yang)(yang)瓶放入4-6%CO 2， 36℃±2℃環(huan)境中，保(bao)持24小時。然后擰緊瓶蓋(gai)，將(jiang)培(pei)(pei)養(yang)(yang)瓶放在(zai)(zai)(zai)36℃±2℃下(xia)孵育7天，在(zai)(zai)(zai)第(di)2天或第(di)3天全(quan)部更換(huan)培(pei)(pei)養(yang)(yang)基。

3．在第7天，用胰蛋白(bai)酶對每一(yi)個含參照或檢(jian)測血清的復式瓶中的細(xi)(xi)胞進(jin)行消化得(de)到一(yi)定數量(liang)細(xi)(xi)胞，然后合并(bing)并(bing)計數。將2x10 5 WI-38細(xi)(xi)胞加入含有新(xin)鮮生長培(pei)養(yang)(yang)基(已加入了(le)與上一(yi)代同一(yi)批次的參照或檢(jian)測胎牛(niu)血清)的新(xin)的復式25-cm 2 瓶中，進(jin)行細(xi)(xi)胞傳(chuan)代培(pei)養(yang)(yang)。按第2步所述，將培(pei)養(yang)(yang)瓶進(jin)行平衡并(bing)孵育(yu)。

4．如(ru)上所(suo)述經過三(san)代連續分析，在每一代結束時計(ji)算每一批參(can)照(zhao)或檢(jian)測血清(qing)的每瓶細胞平均(jun)數。后一代培養的各批檢(jian)測血清(qing)實驗中(zhong)的相(xiang)對生長率(lv)(RGR)作為(wei)參(can)照(zhao)血清(qing)實驗中(zhong)獲得(de)的細胞生長率(lv)分子：

%RGR=檢(jian)測血(xue)(xue)清(qing)(qing)實驗(yan)中每(mei)瓶(ping)平(ping)均細胞(bao)(bao)數/參照血(xue)(xue)清(qing)(qing)實驗(yan)中每(mei)瓶(ping)平(ping)均細胞(bao)(bao)數X100S f9細胞(bao)(bao)生長促進分析(xi)。通(tong)過昆蟲(chong)分析(xi)可(ke)(ke)以(yi)保證您(nin)購買的(de)(de)(de)胎牛血(xue)(xue)清(qing)(qing)批次可(ke)(ke)以(yi)維持(chi)S f9細胞(bao)(bao)的(de)(de)(de)生長。收到產(chan)品(pin)后，您(nin)需(xu)要(yao)做的(de)(de)(de)就是混勻血(xue)(xue)清(qing)(qing)，在56℃下熱滅活30分鐘。這種分析(xi)法(fa)也可(ke)(ke)以(yi)用(yong)于(yu)乳白蛋白水解(jie)產(chan)品(pin)、酵母和其它生長輔料作為原料的(de)(de)(de)生物效能分析(xi)。該分析(xi)法(fa)的(de)(de)(de)準確性取決于(yu)是否用(yong)常規(gui)的(de)(de)(de)細胞(bao)(bao)培養方案進行(xing)培養。用(yong)臺盼藍染色排除法(fa)測得的(de)(de)(de)細胞(bao)(bao)活性少不低于(yu)80%。

細胞生長分析法。

1．使用含10%檢測或參(can)照熱滅活(huo)胎牛血清的已驗證(zheng)的Grace昆(kun)明培養基(ji)配制*檢測培養基(ji)。

2．將儲備Sf9細胞加(jia)入50毫升(sheng)離心管(guan)中，在50Xg下(xia)離心5分鐘(zhong)。然(ran)后將每支試管(guan)的沉淀物(wu)重新(xin)用含10%的檢測或參照(zhao)熱滅活胎牛(niu)血清*培養基配制成(cheng)懸浮(fu)液。

3．反試(shi)管顛倒幾次，然后每支試(shi)管倒出1毫升樣品。用(yong)臺(tai)盼(pan)藍染色(se)排除進行活細胞計(ji)數。

4．如果活性≥80%，把(ba)試管再(zai)顛倒幾次并取出0.25毫升樣(yang)品。然后用(yong)Coulter計數(shu)器進行細(xi)胞計數(shu)。

5．將細(xi)(xi)胞加入Erlenmeyer瓶(ping)中，使其終細(xi)(xi)胞濃度為2.75X10 5 cells/ml。孵育后(hou)，再一次(ci)進行細(xi)(xi)胞計(ji)數，以保證細(xi)(xi)胞密度為2.5X10 5 3.0X10 5 cells/ml。

6．將培養瓶放到搖床上，在27℃±1℃、80-90rpm條件下孵(fu)育96小時。

7．從每一培養瓶(ping)中(zhong)分別取出0.25毫升樣品(pin)，用Coulter計數器進行(xing)計數。同時取出一定(ding)量的樣品(pin)進行(xing)細(xi)胞活性檢測。

8．將檢測細(xi)胞(bao)密度(du)與參照細(xi)胞(bao)密度(du)相比即可(ke)得到相對細(xi)胞(bao)密度(du)(RCN)。

噬(shi)菌(jun)(jun)體檢測:我們利用溶(rong)菌(jun)(jun)斑分析(xi)法來(lai)檢測是(shi)否存在(zai)噬(shi)菌(jun)(jun)體。從每(mei)一批血清中取具代表性(xing)的樣品(pin)加入胰(yi)蛋(dan)白(bai)酶磷酸(suan)(suan)瓊脂中，并在(zai)其加入含有噬(shi)菌(jun)(jun)體敏感的大腸桿菌(jun)(jun)懸浮液(C-3000或K-12)。然(ran)后(hou)，混(hun)合物會在(zai)胰(yi)蛋(dan)白(bai)酶磷酸(suan)(suan)瓊脂平板上分層，在(zai)36±2℃環境下孵育約24小時后(hou)，觀(guan)察(cha)平板上溶(rong)菌(jun)(jun)斑的形態。

生化特征檢測。

血(xue)紅蛋(dan)白檢測：所有批(pi)次(ci)的胎(tai)牛血(xue)清我們都進行了血(xue)紅蛋(dan)白的檢測，血(xue)紅蛋(dan)白含(han)量(liang)低于《中(zhong)國生物制品主要(yao)原輔材(cai)料指控指標》(2000年版)公布的指標。

效能檢測：其它血清

新(xin)生(sheng)牛血(xue)清。檢測(ce)新(xin)生(sheng)牛血(xue)清維持超過三代(dai)(dai)VERO細胞生(sheng)長的能力。在每一個培養(yang)(yang)期(qi)，細胞都從初始(shi)孵育密度開始(shi)傳(chuan)代(dai)(dai)培養(yang)(yang)。可將所(suo)得結(jie)果與使用(yong)含有已(yi)知特征(zheng)的參照血(xue)清對照生(sheng)長培養(yang)(yang)基獲得的平行結(jie)果進行比(bi)較。

馬血(xue)(xue)清。每一(yi)批馬血(xue)(xue)清被檢測維持在(zai)含有檢測批血(xue)(xue)清的(de)(de)對(dui)照培養基上Sp2/0-Ag14(小鼠(shu)骨髓瘤)細胞生長的(de)(de)能力(li)。可將所得結果與使用含有已知特征的(de)(de)參照血(xue)(xue)清對(dui)照生長培養基獲得的(de)(de)平(ping)行結果進行比較。

標準胎(tai)牛血(xue)清的使(shi)(shi)用(yong)與儲(chu)存(cun)：正確的使(shi)(shi)用(yong)及(ji)保存(cun)血(xue)清，才能使(shi)(shi)血(xue)清發揮應有的作用(yong)。

1. 儲存條件：血(xue)清一般儲存于(yu)－20℃，同時(shi)(shi)應(ying)避免反復凍融。購買(mai)大包(bao)裝的血(xue)清后，先要滅(mie)活處理，然后分裝成小包(bao)裝，儲存于(yu)－20℃，使(shi)用前融化。融化時(shi)(shi)好先置于(yu)4℃。融化后的血(xue)清在4℃不宜長時(shi)(shi)間存放，應(ying)盡快(kuai)使(shi)用。

2. 使(shi)用(yong)濃(nong)度：自從(cong)有(you)了合成(cheng)培養基(ji)，血清(qing)就是(shi)作為一種添加成(cheng)分與合成(cheng)培養基(ji)混合使(shi)用(yong)，使(shi)用(yong)濃(nong)度一般(ban)為5－20％，常用(yong)是(shi)10％。過(guo)多血清(qing)容(rong)(rong)易使(shi)培養中(zhong)的(de)細(xi)胞(bao)發生變(bian)化(hua)，特別是(shi)一些二(er)倍體的(de)無限細(xi)胞(bao)系，迅速生長之(zhi)后容(rong)(rong)易發生惡性轉(zhuan)化(hua)。

關于使用中的常見問題

1.保存血清好的辦法？
我(wo)們建(jian)議(yi)血(xue)清應保存在-5℃-20℃。若(ruo)你一(yi)次無法用完一(yi)瓶，建(jian)議(yi)您無菌分裝(zhuang)血(xue)清恰當(dang)的(de)滅菌容(rong)器內，再(zai)放回冷凍。

2.如何解凍血清才不會使產品質量受損？
我們建議您將(jiang)血清從冷凍箱中取(qu)出后(hou)，先置(zhi)于2-8℃冰(bing)箱中使之溶解(jie)，然后(hou)在室溫下(xia)使之全溶。但必須注意的是，溶解(jie)過程中必須規(gui)則(ze)地搖晃均勻(yun)。

3.血清解凍后發現有絮狀沉淀物出現，該如何處理？
血(xue)清(qing)中沉(chen)(chen)淀(dian)物(wu)的(de)(de)出現有(you)許多(duo)原因(yin)(yin)，但普遍的(de)(de)原因(yin)(yin)是由于(yu)血(xue)清(qing)中脂蛋(dan)白的(de)(de)變性造成的(de)(de)；而血(xue)纖維蛋(dan)白(形成凝(ning)血(xue)的(de)(de)蛋(dan)白之一)在(zai)血(xue)清(qing)解凍后，也會存在(zai)于(yu)血(xue)清(qing)中，亦是造成血(xue)清(qing)沉(chen)(chen)淀(dian)物(wu)的(de)(de)主要原因(yin)(yin)之一。但這(zhe)些絮狀沉(chen)(chen)淀(dian)物(wu)，并不影響血(xue)清(qing)本身的(de)(de)質量。

若您(nin)欲去除這(zhe)(zhe)些(xie)絮(xu)狀(zhuang)沉淀物(wu)，可(ke)以(yi)將血(xue)清(qing)分裝無菌離(li)心(xin)管中(zhong)，以(yi)400g稍微離(li)心(xin)，上清(qing)液即(ji)可(ke)接著(zhu)加入培養基內一起過(guo)(guo)濾(lv)(lv)(lv)。我(wo)們不建議您(nin)以(yi)過(guo)(guo)濾(lv)(lv)(lv)的方(fang)法去除這(zhe)(zhe)些(xie)絮(xu)狀(zhuang)沉淀物(wu)，因(yin)為它(ta)可(ke)能(neng)會(hui)阻塞您(nin)的過(guo)(guo)濾(lv)(lv)(lv)膜。

4.何謂熱滅活？有必要做熱滅活嗎？
一般以56℃，30分鐘水(shui)浴來(lai)處(chu)理已解凍的(de)血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)，因為此加熱(re)(re)步驟，可以使補體去活(huo)性(xing)，而補體所參與的(de)反應(ying)有(you)：溶細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)活(huo)性(xing)，平滑肌的(de)收(shou)縮，肥(fei)大細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)和(he)血(xue)(xue)(xue)小(xiao)(xiao)板組胺的(de)釋放(fang)，增(zeng)強吞(tun)噬作(zuo)(zuo)用，淋(lin)巴細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)、巨噬細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)趨化和(he)激活(huo)。實(shi)驗顯示(shi)，經(jing)過(guo)正確處(chu)理的(de)熱(re)(re)滅活(huo)血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)，對大多數的(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)而言是不(bu)需要的(de)。經(jing)過(guo)處(chu)理的(de)血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)對細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)生長只有(you)微小(xiao)(xiao)的(de)促進(jin)，或(huo)*沒有(you)任(ren)何作(zuo)(zuo)用，甚(shen)通常(chang)因為高溫(wen)處(chu)理影響(xiang)了血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)的(de)質量，而造成細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)生長速率的(de)降低(di)。

而(er)經過(guo)熱(re)處(chu)理的(de)(de)(de)血(xue)清(qing)(qing)，沉(chen)淀物(wu)(wu)的(de)(de)(de)形成(cheng)會(hui)(hui)顯著的(de)(de)(de)增多，這(zhe)些沉(chen)淀物(wu)(wu)在(zai)倒(dao)置顯微鏡下(xia)觀察，像(xiang)是(shi)“小黑點(dian)"，常(chang)(chang)常(chang)(chang)會(hui)(hui)讓研究(jiu)者誤以(yi)(yi)為(wei)是(shi)血(xue)清(qing)(qing)遭受污染(ran)，而(er)把血(xue)清(qing)(qing)放在(zai)37℃環境中，又會(hui)(hui)使此(ci)沉(chen)淀物(wu)(wu)更增多，使研究(jiu)者認為(wei)是(shi)微生物(wu)(wu)的(de)(de)(de)分裂擴增。因此(ci)我們建議您(nin)，若(ruo)非(fei)必須，您(nin)可以(yi)(yi)不(bu)需要做熱(re)滅活這(zhe)一(yi)步。如此(ci)以(yi)(yi)來，不(bu)但節省您(nin)寶(bao)貴的(de)(de)(de)時(shi)間(jian)，更確保您(nin)血(xue)清(qing)(qing)的(de)(de)(de)質量！

5.如何避免沉淀物的出現？
我們(men)建議您在(zai)使用血(xue)清(qing)的(de)時(shi)(shi)候，注(zhu)意(yi)正(zheng)確的(de)血(xue)清(qing)解凍(dong)步驟，并盡量避免滅活(huo)血(xue)清(qing)及長時(shi)(shi)間(jian)的(de)將血(xue)清(qing)置于高溫環境(jing)中。

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