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新西蘭血源胎牛血清

新(xin)西蘭血源胎牛血清通常(chang)作為補(bu)充成(cheng)(cheng)分(fen)(fen)添加在(zai)基礎培(pei)養(yang)基內使(shi)用。它(ta)能夠提供各種大分(fen)(fen)子(zi)蛋(dan)白，小(xiao)分(fen)(fen)子(zi)量營養(yang)，水溶(rong)性成(cheng)(cheng)分(fen)(fen)的(de)轉運(yun)蛋(dan)白，和(he)(he)其它(ta)一些(xie)細(xi)(xi)胞(bao)在(zai)體外所必需(xu)的(de)成(cheng)(cheng)分(fen)(fen)，如激素(su)和(he)(he)附(fu)著因(yin)子(zi)。血(xue)清(qing)可以(yi)結合(he)或中(zhong)(zhong)和(he)(he)一些(xie)生長因(yin)子(zi)中(zhong)(zhong)的(de)有毒成(cheng)(cheng)分(fen)(fen)，并提供培(pei)養(yang)基的(de)緩沖能力。細(xi)(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)時血(xue)清(qing)的(de)添加依賴(lai)于基礎培(pei)養(yang)基的(de)化學組(zu)成(cheng)(cheng)，培(pei)養(yang)細(xi)(xi)胞(bao)的(de)類型，及所用的(de)培(pei)養(yang)系(xi)統。

我們在提供(gong)細胞培養基、平衡鹽溶液、無血(xue)清培養基和(he)試劑(ji)的(de)(de)(de)同時(shi)，還提供(gong)高(gao)品(pin)(pin)(pin)質(zhi)的(de)(de)(de)血(xue)清。我們對(dui)血(xue)清制(zhi)備(bei)進行全過程監管。從血(xue)清收集(ji)到終(zhong)產品(pin)(pin)(pin)檢驗(yan)和(he)內部稽核的(de)(de)(de)每(mei)一個(ge)(ge)步(bu)驟，我們都采用設備(bei)和(he)標準操作程序，以確保整(zheng)個(ge)(ge)過程中每(mei)個(ge)(ge)環(huan)節的(de)(de)(de)產品(pin)(pin)(pin)質(zhi)量。對(dui)整(zheng)個(ge)(ge)過程的(de)(de)(de)控(kong)制(zhi)可以保證產品(pin)(pin)(pin)的(de)(de)(de)持續(xu)高(gao)品(pin)(pin)(pin)質(zhi)，降低(di)不同批次的(de)(de)(de)差(cha)異。

處(chu)理：全部血清(qing)(qing)：收集的血液均在冷藏條件下處(chu)理。血清(qing)(qing)分離后立(li)即將血清(qing)(qing)合并并冷凍。只(zhi)有符合我們(men)的檢測(ce)標準的血清(qing)(qing)才被接受作(zuo)進(jin)一步處(chu)理。

熱滅(mie)活(huo)血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)：熱滅(mie)活(huo)是在(zai)(zai)(zai)56℃水浴(yu)中(zhong)嚴格控(kong)溫(wen)30分鐘。透析(xi)血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)：用(yong)10,000截留分子(zi)量(liang)的(de)(de)(de)(de)透析(xi)膜在(zai)(zai)(zai)0.15M的(de)(de)(de)(de)NaCl中(zhong)進(jin)行透析(xi)，直到(dao)葡(pu)萄糖水平低(di)于5mg/dl(用(yong)鄰甲苯胺(an)測試法檢(jian)驗)。γ射(she)線照(zhao)(zhao)射(she)血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)：可按客戶要(yao)求對血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)進(jin)行γ射(she)線照(zhao)(zhao)射(she)。通(tong)(tong)過(guo)(guo)(guo)γ射(she)線照(zhao)(zhao)射(she)以滅(mie)活(huo)各種動物(wu)(wu)血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)(包括(kuo)(kuo)胎牛(niu)(niu)血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)、新生牛(niu)(niu)血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)、豬血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)和馬血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing))中(zhong)的(de)(de)(de)(de)病毒和支(zhi)原體(ti)的(de)(de)(de)(de)方(fang)法已經得到(dao)證(zheng)實(shi)。研究證(zheng)實(shi)照(zhao)(zhao)射(she)劑量(liang)在(zai)(zai)(zai)30-45kGy為宜。血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)在(zai)(zai)(zai)此照(zhao)(zhao)射(she)后(hou)物(wu)(wu)理化學特性和細胞培養表(biao)現(xian)沒有變化。裝瓶(ping)：粗血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)須通(tong)(tong)過(guo)(guo)(guo)一系列的(de)(de)(de)(de)過(guo)(guo)(guo)濾(lv)才成(cheng)為成(cheng)品(pin)。后(hou)的(de)(de)(de)(de)過(guo)(guo)(guo)濾(lv)步驟(zou)包括(kuo)(kuo)使(shi)用(yong)0.2um和0.1um的(de)(de)(de)(de)無(wu)菌過(guo)(guo)(guo)濾(lv)。胎牛(niu)(niu)血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)須通(tong)(tong)過(guo)(guo)(guo)三次(ci)0.1um過(guo)(guo)(guo)濾(lv)，其(qi)他血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)須通(tong)(tong)過(guo)(guo)(guo)0.2um過(guo)(guo)(guo)濾(lv)。終產(chan)品(pin)的(de)(de)(de)(de)質量(liang)控(kong)制(zhi)：我們采取(qu)以下方(fang)法對每(mei)一批次(ci)的(de)(de)(de)(de)產(chan)品(pin)選(xuan)取(qu)一定數量(liang)的(de)(de)(de)(de)樣(yang)品(pin)進(jin)行質量(liang)控(kong)制(zhi)分析(xi)：

化學檢(jian)測(ce)：使(shi)用(yong)低溫凝固點的(de)(de)方法(fa)檢(jian)測(ce)滲(shen)透壓，以保證(zheng)符合產(chan)品(pin)規(gui)范。我們每天(tian)使(shi)用(yong)國(guo)(guo)家標(biao)(biao)準(zhun)的(de)(de)技術研(yan)(yan)究(jiu)所標(biao)(biao)定的(de)(de)標(biao)(biao)準(zhun)溶液(ye)對我們的(de)(de)滲(shen)透壓檢(jian)測(ce)儀器(qi)進行(xing)校準(zhun)。同樣每天(tian)使(shi)用(yong)國(guo)(guo)家標(biao)(biao)準(zhun)技術研(yan)(yan)究(jiu)所標(biao)(biao)定的(de)(de)標(biao)(biao)準(zhun)溶液(ye)對pH計(ji)進行(xing)校準(zhun)。

使用(yong)電泳圖(tu)譜鑒(jian)定血(xue)清的(de)(de)整體性(xing)質(zhi)。樣品被轉(zhuan)移(yi)到(dao)硝酸纖維素基質(zhi)中，并在緩沖體系(xi)內遷(qian)移(yi)。條帶經(jing)染(ran)色(se)、清潔、干燥(zao)后用(yong)密度儀進行掃(sao)描，以檢(jian)測(ce)(ce)白(bai)蛋白(bai)和球蛋白(bai)組分的(de)(de)相對濃度。為證實是(shi)否在適當的(de)(de)條件下進行采血(xue)和處(chu)理，使用(yong)修飾(shi)的(de)(de)Fleming方法對血(xue)紅蛋白(bai)進行分光光度檢(jian)測(ce)(ce)。

隨著(zhu)動(dong)物(wu)年齡(ling)的(de)增(zeng)加，血(xue)清總蛋(dan)白含量(liang)也(ye)相應地(di)提高。使(shi)用自(zi)動(dong)化的(de)Biuret方(fang)法進(jin)行總血(xue)清蛋(dan)白的(de)檢測，以確(que)認動(dong)物(wu)年齡(ling)并(bing)驗證符合產品規范。使(shi)用色度計(ji)在不同波(bo)長下(xia)檢測樣品和Biuret試劑(ji)混合波(bo)的(de)吸光度。自(zi)動(dong)計(ji)算結(jie)果后，與標準曲線(xian)比較(jiao)，即可得到蛋(dan)白值(克/公升(sheng))。

穩定性檢測程(cheng)序：在每(mei)一個(ge)標記為體外(wai)診斷的(de)產品(pin)上顯示的(de)效(xiao)期(qi)(qi)表(biao)明了這個(ge)產品(pin)具有(you)多(duo)長時(shi)間的(de)效(xiao)能。我(wo)們的(de)穩定性程(cheng)序確定和證明了產品(pin)效(xiao)期(qi)(qi)。我(wo)們定期(qi)(qi)監測批量產品(pin)，確定產品(pin)在推(tui)薦(jian)貯存條件下(xia)具有(you)可接受效(xiao)果(guo)的(de)時(shi)間長度。

微生物學檢(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)：所有(you)(you)血清(qing)使(shi)用(yong)Barile&Kern的(de)大體積方法(fa)檢(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)支(zhi)原(yuan)體。在(zai)推(tui)薦(jian)方法(fa)的(de)檢(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)范圍內檢(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)結果(guo)是準(zhun)確(que)的(de)。樣品少(shao)應該在(zai)肉湯(tang)中合并培養3個星期，同時要(yao)在(zai)瓊(qiong)脂平(ping)(ping)(ping)板上進(jin)行(xing)(xing)不(bu)少(shao)于4次(ci)傳(chuan)代培養。在(zai)有(you)(you)氧(yang)和(he)厭氧(yang)(95%氮(dan)，5%CO2)條(tiao)件下，平(ping)(ping)(ping)板在(zai)36±2℃下孵育(yu)。在(zai)檢(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)過程中，每(mei)周對瓊(qiong)脂平(ping)(ping)(ping)板進(jin)行(xing)(xing)一(yi)次(ci)微生物生長情況(kuang)檢(jian)(jian)(jian)(jian)驗。使(shi)用(yong)Dienes染(ran)(ran)色法(fa)對懷疑被污染(ran)(ran)的(de)瓊(qiong)脂平(ping)(ping)(ping)板進(jin)行(xing)(xing)支(zhi)原(yuan)體菌落的(de)檢(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)。然后，對平(ping)(ping)(ping)板進(jin)行(xing)(xing)再次(ci)鏡(jing)檢(jian)(jian)(jian)(jian)。對孵育(yu)肉湯(tang)瓶要(yao)定期進(jin)行(xing)(xing)濁度和(he)pH值變動(dong)的(de)檢(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)。在(zai)推(tui)薦(jian)方法(fa)檢(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)范圍內，所有(you)(you)血清(qing)也要(yao)使(shi)用(yong)Hoechst熒光DNA染(ran)(ran)色法(fa)進(jin)行(xing)(xing)不(bu)可(ke)在(zai)肉湯(tang)中培養的(de)支(zhi)原(yuan)體(包括M.hyorhinis屬)檢(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)。

病(bing)毒(du)檢(jian)(jian)測(ce)：已知(zhi)無外來物質(zhi)(zhi)的(de)(de)細胞培(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)基須經過在包含15%測(ce)試血(xue)清的(de)(de)生(sheng)長培(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)基中進行(xing)為(wei)期21天(tian)的(de)(de)三次傳代(dai)培(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)。使用對照培(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)基和已知(zhi)對外來物質(zhi)(zhi)為(wei)陰(yin)性的(de)(de)血(xue)清平行(xing)地維(wei)持(chi)陰(yin)性對照培(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)。整個期間，檢(jian)(jian)測(ce)所有的(de)(de)培(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)情況，以便發(fa)現是否(fou)存(cun)在病(bing)毒(du)誘發(fa)的(de)(de)細胞形(xing)態(tai)改變或(huo)致細胞病(bing)變效應。在1421天(tian)的(de)(de)培(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)期間，對含有檢(jian)(jian)測(ce)血(xue)清的(de)(de)平行(xing)培(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)瓶(ping)按下(xia)面標準病(bing)毒(du)檢(jian)(jian)測(ce)方法進行(xing)評估(gu)。

將其中一(yi)瓶檢(jian)(jian)測(ce)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)用胰(yi)蛋白酶(mei)消(xiao)化，然后把細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)分別加(jia)(jia)入到總(zong)面積為6cm 2 的(de)(de)六室載玻片上(shang)。同時準備陰(yin)性(xing)(xing)對(dui)(dui)照載玻片。在(zai)檢(jian)(jian)測(ce)培(pei)養(yang)的(de)(de)單(dan)室載玻片上(shang)加(jia)(jia)入牛病(bing)毒(du)性(xing)(xing)腹(fu)瀉(xie)病(bing)毒(du)(BVDV)、牛細(xi)(xi)(xi)小病(bing)毒(du)、牛腺病(bing)毒(du)、狂犬(quan)病(bing)毒(du)和(he)呼腸病(bing)毒(du)的(de)(de)染色劑，作為單(dan)個的(de)(de)陽(yang)性(xing)(xing)對(dui)(dui)照。再經過7天培(pei)養(yang)(總(zong)共21天)，利(li)用熒光抗體(ti)技術(shu)檢(jian)(jian)測(ce)病(bing)毒(du)。

通過對檢測(ce)培養(yang)進行蘇木精伊紅染色(se)，觀察致細胞(bao)突(tu)變效應(ying)(CPE)或(huo)其他(ta)病毒(du)誘導(dao)效應(ying)。檢測(ce)細胞(bao)是(shi)否存在CPE效應(ying)、內含物、多核體或(huo)其他(ta)異常效應(ying)。

內毒素檢(jian)測(ce)：我們(men)用阿(a)米巴變形(xing)細(xi)胞溶解物(LAL)凝膠法來檢(jian)測(ce)胎牛(niu)血清的內毒素含量(liang)。

效能檢測：
對每一批次的(de)(de)胎牛血(xue)清(qing)，我們都(dou)進行下(xia)述培養(yang)效(xiao)(xiao)(xiao)能(neng)檢測(ce)。選擇血(xue)清(qing)重要的(de)(de)標準是其支持特(te)殊細胞(bao)的(de)(de)生長能(neng)力(li)。因(yin)此，除(chu)了保證血(xue)清(qing)通過嚴格的(de)(de)品(pin)質控(kong)制，我們也同時(shi)在實驗室(shi)條(tiao)件下(xia)對血(xue)清(qing)的(de)(de)三個重要的(de)(de)培養(yang)效(xiao)(xiao)(xiao)能(neng)進行檢測(ce)：克(ke)隆效(xiao)(xiao)(xiao)率、貼壁(bi)效(xiao)(xiao)(xiao)果和二倍體(ti)成纖維(wei)細胞(bao)生長促進。

克隆效率分析：克隆效率實驗分析每一批胎牛血清促進小鼠骨髓瘤細胞及其衍生的雜交瘤細胞的克隆和生長能力。下列產品
經驗證可用于該實驗：
Sp2/0-Ag14(ATCC #CRL 1581)
P3x63-Ag8.653(ATCC #CRL 1580)

每一批胎牛血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)都要分(fen)別在復制微量滴定平板上加入(ru)兩種血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)濃(nong)(nong)度和兩種細胞接種量(10%血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)和1cell/孔(kong)，4%血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)和5cells/孔(kong))的(de)情況下(xia)進行(xing)分(fen)析。克隆分(fen)析結果除(chu)以(yi)已確定的(de)參照血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)值得以(yi)歸一化。在許(xu)多日常雜(za)交選擇程序中具有代表性的(de)是(shi)高(gao)濃(nong)(nong)度的(de)血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)，而(er)低濃(nong)(nong)度血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)在設計血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)批次(ci)細微差異放大檢測中有更為(wei)嚴格(ge)的(de)測試。嚴格(ge)的(de)1cell/孔(kong)測試是(shi)模擬單一雜(za)交選擇的(de)實驗室條(tiao)件。為(wei)每一批次(ci)胎牛血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)提供的(de)分(fen)析證明報告中的(de)克隆效(xiao)率值為(wei)兩次(ci)測試條(tiao)件下(xia)的(de)平均值。

克隆分析法：克隆分析法是在復式96孔板中加入兩種胎牛血清濃度(10%v/v)和(4%v/v)和兩種接種量的情況下進行的。每一次化驗中，同時測量前期已驗證合格的一批胎牛血清，并將此測量值作為內部參考標準。
克隆(long)分析按下述方法(fa)進行：

1．Sp2/0-Ag14(sp2)和(he)P3x63-Ag8.653(653)在含有10%的胎牛血清的RPM1640中通(tong)常保持對數生長期。在顯微鏡下，利用(yong)臺盼藍排除法對活細胞(bao)進行計(ji)數。

2．用RPM1640培(pei)養(yang)(yang)基將儲備(bei)細(xi)胞(bao)懸浮液進行連續稀釋(shi)，使其達到預(yu)期(qi)的(de)25cells/ml和5cells/ml接種(zhong)(zhong)濃度(du)。準備(bei)含有(you)(you)參照或測試胎牛血清的(de)RPM1640培(pei)養(yang)(yang)基。將這種(zhong)(zhong)密度(du)的(de)細(xi)胞(bao)分(fen)配到各個(ge)分(fen)析生長培(pei)養(yang)(yang)基體積(ji)為0.2毫升(sheng)的(de)孔中，使其分(fen)別(bie)平均含有(you)(you)5個(ge)和1個(ge)細(xi)胞(bao)。

3．將96孔板放入36±2℃，4-6% CO 2 的潮濕培養箱孵育約1015天(tian)。

4．在孵育(yu)期間，用肉眼(yan)觀察平(ping)板并對(dui)用于(yu)克(ke)隆(long)的孔(kong)進行計數(shu)。克(ke)隆(long)效率(lv)按下(xia)列方法計算(suan)：克(ke)隆(long)效率(lv)=(陽性(xing)孔(kong)平(ping)均數(shu)/孵育(yu)孔(kong)總(zong)數(shu))×100%

5．每(mei)一批次胎(tai)牛血清維持指示(shi)劑(ji)骨髓瘤細胞克隆(long)(long)效(xiao)(xiao)率的(de)(de)(de)定量(liang)按照以(yi)下方法測得的(de)(de)(de)相對克隆(long)(long)效(xiao)(xiao)率(RCE)進行歸一化：RCE=檢(jian)測血清的(de)(de)(de)克隆(long)(long)效(xiao)(xiao)率/對照血清的(de)(de)(de)克隆(long)(long)效(xiao)(xiao)率貼(tie)(tie)壁效(xiao)(xiao)率分(fen)析：貼(tie)(tie)壁效(xiao)(xiao)率分(fen)析是(shi)利用已(yi)轉型的(de)(de)(de)人類細胞系來檢(jian)測每(mei)一批血清促使持續(xu)貼(tie)(tie)附細胞系的(de)(de)(de)生長能力(li)。選擇已(yi)被驗(yan)證可(ke)以(yi)檢(jian)測貼(tie)(tie)壁效(xiao)(xiao)率的(de)(de)(de)細胞系A549(人肺(fei)腫瘤細胞，ATCC#CCL,185)，是(shi)因為它可(ke)以(yi)區分(fen)一批血清維持細胞貼(tie)(tie)壁和繁(fan)殖能力(li)的(de)(de)(de)細微(wei)差異。

每一批次(ci)胎(tai)牛(niu)血(xue)(xue)清(qing)都要(yao)在兩種(zhong)血(xue)(xue)清(qing)濃(nong)(nong)度和(he)兩種(zhong)細胞(bao)接(jie)種(zhong)濃(nong)(nong)度下(10%血(xue)(xue)清(qing)和(he)100cells/孔，4%血(xue)(xue)清(qing)和(he)200cells/孔)測試(shi)三次(ci)。在36±2℃，4-6% CO 2 的(de)(de)潮濕培養箱孵育(yu)約1014天，對(dui)被染色的(de)(de)細胞(bao)菌落進行計數即可得到其貼壁(bi)效(xiao)率。將結果(guo)除以參考的(de)(de)對(dui)照血(xue)(xue)清(qing)得以歸一化。通過(guo)兩種(zhong)血(xue)(xue)清(qing)濃(nong)(nong)度的(de)(de)測試(shi)，可以驗證該批次(ci)血(xue)(xue)清(qing)在減量和(he)標(biao)準水(shui)平(ping)(ping)下維持生長的(de)(de)能力。為每一批次(ci)胎(tai)牛(niu)血(xue)(xue)清(qing)提供的(de)(de)分(fen)析(xi)證明報告(gao)中的(de)(de)貼壁(bi)效(xiao)率值(zhi)為兩次(ci)測試(shi)條件(jian)下的(de)(de)平(ping)(ping)均值(zhi)。

貼壁分析(xi)法(fa)(fa)：使用貼附分析(xi)檢測(ce)上述每(mei)一批測(ce)試血清。這種分析(xi)法(fa)(fa)針對每(mei)一個血清樣品使用一個6孔(kong)板(ban)(每(mei)室9.6cm 2 )，并可(ke)以對三(san)個孔(kong)的(de)數據進行平均處理(li)。每(mei)一次化驗中，同時測(ce)量前(qian)期已驗證合格的(de)一批胎(tai)牛血清，并將此測(ce)量值作為內部(bu)參考標(biao)準。

貼(tie)附分析按下述方法(fa)進行：

1．A549細胞系用含(han)有10%胎牛血清的DMEM培(pei)養基，在36±2℃，以亞融合密度(du)下進行培(pei)養。

2．含10%(v/v)和(he)(he)4%(v/v)血(xue)清(qing)的DMEM由分別在(zai)22.5毫(hao)升和(he)(he)24毫(hao)升DMEM中加入(ru)2.5毫(hao)升和(he)(he)1毫(hao)升胎牛(niu)血(xue)清(qing)配(pei)制而成(cheng)，終(zhong)有效體積為25毫(hao)升。將5毫(hao)升含血(xue)清(qing)培養基分別加入(ru)6孔板的每一(yi)個孔中。

3．A549培養細胞(bao)先經過胰蛋白酶(mei)消化，測定活細胞(bao)數，然后稀釋細胞(bao)懸浮液2,000cells/ml。

4．將0.1毫(hao)升(sheng)細胞懸(xuan)浮(fu)液加(jia)(jia)入(ru)(ru)200cells/孔室(shi)中，0.05毫(hao)升(sheng)懸(xuan)浮(fu)液加(jia)(jia)入(ru)(ru)100cells/孔室(shi)中。平(ping)板混合后放入(ru)(ru)36±2℃，5%CO 2 的潮濕培養(yang)箱孵育約1014天。

5．孵(fu)育后，取出平板，去除生長培養基，用亞(ya)甲(jia)基蘭-甲(jia)醇溶(rong)液(ye)對菌落進(jin)行染色(se)。

6．計算菌落(luo)形(xing)成，然后(hou)按下述方法(fa)計算貼壁效率：%貼壁效率=每孔(kong)菌落(luo)平均(jun)數/每孔(kong)孵育活細胞(bao)平均(jun)數×100

7．為方便比較(jiao)，將測得(de)的(de)(de)貼(tie)壁(bi)效率(lv)(lv)數值除以(yi)每(mei)批(pi)檢(jian)測血清(qing)(qing)的(de)(de)相(xiang)對貼(tie)壁(bi)效率(lv)(lv)(RPE)得(de)以(yi)歸一化：RCE=檢(jian)測血清(qing)(qing)的(de)(de)貼(tie)壁(bi)效率(lv)(lv)/參照血清(qing)(qing)的(de)(de)貼(tie)壁(bi)效率(lv)(lv)二倍體成(cheng)(cheng)纖維(wei)細胞(bao)生(sheng)長(chang)：促進生(sheng)長(chang)分析用于檢(jian)測每(mei)一批(pi)胎牛血清(qing)(qing)維(wei)持難(nan)培(pei)養(yang)的(de)(de)人二倍體成(cheng)(cheng)纖維(wei)細胞(bao)長(chang)期生(sheng)長(chang)的(de)(de)能力。

下(xia)列細胞系經(jing)認證(zheng)可用于該(gai)實(shi)驗：

WI-38(人二倍體肺成纖維細胞，ATCC#CCL 75)

WI-38細(xi)胞(bao)在含5%胎牛血(xue)(xue)(xue)清(qing)的(de)(de)低密度(2X10 5 /瓶)復式25-cm 2瓶中(zhong)孵育(yu)，并進行為期三個連續(xu)7天的(de)(de)傳(chuan)代(dai)培(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)。在每一(yi)(yi)個培(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)期，細(xi)胞(bao)都從初始孵育(yu)密度開始傳(chuan)代(dai)培(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)。壓(ya)力(li)分層率、成倍(bei)繁殖數量(liang)和減量(liang)血(xue)(xue)(xue)清(qing)濃(nong)度是每批次(ci)(ci)促進難培(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)二(er)倍(bei)體(ti)細(xi)胞(bao)的(de)(de)生長(chang)血(xue)(xue)(xue)清(qing)的(de)(de)嚴格測試指標。通過連續(xu)三代(dai)培(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)以(yi)減少前一(yi)(yi)次(ci)(ci)生長(chang)培(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)基的(de)(de)殘(can)留影響(xiang)，從而保(bao)證(zheng)得到檢(jian)(jian)測批促進生長(chang)能力(li)的(de)(de)真實結果。為每一(yi)(yi)批次(ci)(ci)胎牛血(xue)(xue)(xue)清(qing)提供的(de)(de)分析(xi)證(zheng)明報告為第三次(ci)(ci)傳(chuan)代(dai)培(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)每復式培(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)瓶細(xi)胞(bao)數的(de)(de)平均值(zhi)。將檢(jian)(jian)測值(zhi)除以(yi)參考對照(zhao)值(zhi)得以(yi)歸一(yi)(yi)化。

二倍體(ti)成(cheng)纖維細(xi)(xi)胞生長(chang)(chang)分析法：培養數(shu)代(dai)WI-38人類二倍體(ti)肺成(cheng)纖維細(xi)(xi)胞，計算每一代(dai)的(de)細(xi)(xi)胞總數(shu)。此項檢測所挑選(xuan)出的(de)胎牛血清批號能(neng)維持難以生長(chang)(chang)細(xi)(xi)胞、貼壁性細(xi)(xi)胞、正(zheng)常的(de)細(xi)(xi)胞株生長(chang)(chang)及存活。

1．準備(bei)含(han)5%檢測血(xue)(xue)清(qing)或(huo)已驗證(zheng)合格的參照血(xue)(xue)清(qing)生(sheng)長培養基(ji)，基(ji)礎生(sheng)長培養基(ji)為含(han)L-谷氨(an)酰胺(an)的HBME：EBME(1：1)。按(an)要求，在(zai)每(mei)一(yi)次流量變化和分析過(guo)程中進行傳代培養時(shi)需(xu)配制(zhi)含(han)5%血(xue)(xue)清(qing)生(sheng)長的培養基(ji)。

2．在(zai)低代培(pei)養(yang)水平(ping)時，將(jiang)2X10 5 WI-38細胞加入各個含9.5毫升生長(chang)培(pei)養(yang)基的復(fu)式(shi)25-cm 2 培(pei)養(yang)基中(zhong)。在(zai)不擰緊瓶(ping)(ping)蓋的情況(kuang)下，將(jiang)培(pei)養(yang)瓶(ping)(ping)放入4-6%CO 2， 36℃±2℃環境中(zhong)，保持(chi)24小時。然后擰緊瓶(ping)(ping)蓋，將(jiang)培(pei)養(yang)瓶(ping)(ping)放在(zai)36℃±2℃下孵育7天，在(zai)第(di)2天或第(di)3天全部更(geng)換(huan)培(pei)養(yang)基。

3．在第7天，用胰蛋白酶對每一(yi)個含(han)參照或檢(jian)測血(xue)清的(de)復式瓶中的(de)細胞(bao)進行消化得(de)到一(yi)定數量細胞(bao)，然后合并并計數。將2x10 5 WI-38細胞(bao)加(jia)(jia)入含(han)有新(xin)(xin)鮮生長培養基(ji)(已加(jia)(jia)入了與上一(yi)代同一(yi)批次的(de)參照或檢(jian)測胎(tai)牛血(xue)清)的(de)新(xin)(xin)的(de)復式25-cm 2 瓶中，進行細胞(bao)傳(chuan)代培養。按第2步所(suo)述，將培養瓶進行平衡(heng)并孵育。

4．如上所述經過三代連續(xu)分析，在每(mei)(mei)一(yi)代結束時計算每(mei)(mei)一(yi)批(pi)參照或檢測血(xue)清(qing)的(de)每(mei)(mei)瓶細(xi)胞平均數。后一(yi)代培養的(de)各(ge)批(pi)檢測血(xue)清(qing)實驗中的(de)相對生(sheng)長(chang)率(RGR)作為參照血(xue)清(qing)實驗中獲得的(de)細(xi)胞生(sheng)長(chang)率分子：

%RGR=檢測(ce)血清實(shi)驗中(zhong)每(mei)瓶平(ping)均細(xi)胞(bao)(bao)數/參照血清實(shi)驗中(zhong)每(mei)瓶平(ping)均細(xi)胞(bao)(bao)數X100S f9細(xi)胞(bao)(bao)生(sheng)長(chang)(chang)促進分析(xi)。通過(guo)昆蟲分析(xi)可以保證(zheng)您(nin)購買的(de)胎牛血清批次可以維持S f9細(xi)胞(bao)(bao)的(de)生(sheng)長(chang)(chang)。收到(dao)產品后，您(nin)需要(yao)做的(de)就(jiu)是混勻血清，在56℃下熱滅活30分鐘。這種分析(xi)法也可以用(yong)于乳(ru)白蛋白水解產品、酵母和其它生(sheng)長(chang)(chang)輔(fu)料(liao)作為原(yuan)料(liao)的(de)生(sheng)物效能分析(xi)。該分析(xi)法的(de)準確性取(qu)決于是否(fou)用(yong)常規(gui)的(de)細(xi)胞(bao)(bao)培養方(fang)案進行培養。用(yong)臺盼藍染色排除法測(ce)得的(de)細(xi)胞(bao)(bao)活性少(shao)不低于80%。

細胞生長分析法。

1．使用含10%檢測(ce)或參照熱滅活胎牛血清的已驗證的Grace昆明培養基配制*檢測(ce)培養基。

2．將儲備(bei)Sf9細胞加入(ru)50毫(hao)升離心(xin)管中，在50Xg下離心(xin)5分(fen)鐘(zhong)。然后將每(mei)支試(shi)管的(de)沉淀(dian)物重新用含10%的(de)檢測或參照熱滅活胎牛血清(qing)*培養基(ji)配制成(cheng)懸浮(fu)液。

3．反試管顛倒幾次，然后每(mei)支試管倒出1毫升樣品。用臺盼藍(lan)染色排(pai)除進(jin)行活(huo)細胞計數。

4．如果活性≥80%，把試(shi)管再顛倒(dao)幾次(ci)并取出(chu)0.25毫升樣(yang)品。然后用Coulter計數(shu)器進行(xing)細胞(bao)計數(shu)。

5．將細(xi)(xi)胞(bao)加(jia)入(ru)Erlenmeyer瓶中，使其終(zhong)細(xi)(xi)胞(bao)濃度為(wei)2.75X10 5 cells/ml。孵(fu)育后，再一次進行(xing)細(xi)(xi)胞(bao)計數，以保證細(xi)(xi)胞(bao)密度為(wei)2.5X10 5 3.0X10 5 cells/ml。

6．將(jiang)培養瓶放(fang)到(dao)搖床上，在27℃±1℃、80-90rpm條件下孵育96小時。

7．從每一(yi)培養瓶中(zhong)分(fen)別取(qu)出0.25毫升樣(yang)品，用Coulter計數(shu)器進(jin)行計數(shu)。同(tong)時取(qu)出一(yi)定(ding)量的(de)樣(yang)品進(jin)行細胞活性檢測。

8．將檢測細胞(bao)密(mi)度(du)與參照細胞(bao)密(mi)度(du)相(xiang)比即可(ke)得(de)到相(xiang)對細胞(bao)密(mi)度(du)(RCN)。

噬(shi)菌(jun)體檢(jian)測:我們利用溶菌(jun)斑分(fen)(fen)析法來檢(jian)測是否存(cun)在(zai)噬(shi)菌(jun)體。從每一(yi)批(pi)血(xue)清中取具(ju)代表性的樣品加(jia)入(ru)胰(yi)蛋白酶磷酸瓊(qiong)(qiong)脂中，并在(zai)其(qi)加(jia)入(ru)含有噬(shi)菌(jun)體敏感(gan)的大腸桿菌(jun)懸浮液(ye)(C-3000或K-12)。然(ran)后(hou)，混合(he)物(wu)會在(zai)胰(yi)蛋白酶磷酸瓊(qiong)(qiong)脂平(ping)板(ban)上(shang)分(fen)(fen)層，在(zai)36±2℃環境下孵育約24小(xiao)時后(hou)，觀察平(ping)板(ban)上(shang)溶菌(jun)斑的形態。

生化特征檢測。

血(xue)紅蛋白檢(jian)測(ce)(ce)：所有(you)批次的胎牛血(xue)清我們(men)都進行了血(xue)紅蛋白的檢(jian)測(ce)(ce)，血(xue)紅蛋白含量低于《中國生(sheng)物制(zhi)品主要原(yuan)輔材料指(zhi)(zhi)控(kong)指(zhi)(zhi)標》(2000年版)公布的指(zhi)(zhi)標。

效能檢測：其它血清

新(xin)(xin)生(sheng)牛血(xue)清(qing)。檢測(ce)新(xin)(xin)生(sheng)牛血(xue)清(qing)維持超過(guo)三代VERO細胞生(sheng)長的(de)能力。在每(mei)一個培(pei)養(yang)期，細胞都從初始孵育(yu)密度(du)開始傳(chuan)代培(pei)養(yang)。可將(jiang)所得結果(guo)與使用含有已知特征的(de)參照血(xue)清(qing)對(dui)照生(sheng)長培(pei)養(yang)基獲得的(de)平(ping)行結果(guo)進行比(bi)較。

馬血清(qing)(qing)(qing)。每一(yi)批馬血清(qing)(qing)(qing)被檢(jian)測(ce)維(wei)持在含有(you)檢(jian)測(ce)批血清(qing)(qing)(qing)的(de)(de)對照培養基(ji)上Sp2/0-Ag14(小鼠骨(gu)髓瘤)細胞生(sheng)長的(de)(de)能力。可將所得結果與使用含有(you)已知特征的(de)(de)參照血清(qing)(qing)(qing)對照生(sheng)長培養基(ji)獲得的(de)(de)平行(xing)結果進行(xing)比較。

血清的(de)使用與儲(chu)存(cun)(cun)：正確的(de)使用及保存(cun)(cun)血清，才能使血清發揮應有的(de)作用。

1. 儲存條件：血(xue)清(qing)一般(ban)儲存于(yu)－20℃，同時應避免反復凍融。購(gou)買大包裝的血(xue)清(qing)后(hou)，先(xian)要滅活處理，然后(hou)分裝成(cheng)小包裝，儲存于(yu)－20℃，使(shi)用前融化(hua)。融化(hua)時推薦先(xian)置于(yu)4℃。融化(hua)后(hou)的血(xue)清(qing)在(zai)4℃不(bu)宜(yi)長時間存放，應盡快使(shi)用。

2. 使用濃度(du)：自從有了合成培(pei)養(yang)基(ji)，血清就是(shi)作(zuo)為一種添加成分與合成培(pei)養(yang)基(ji)混(hun)合使用，使用濃度(du)一般為5－20％，常(chang)用是(shi)10％。過(guo)多血清容易使培(pei)養(yang)中的細(xi)胞發(fa)生(sheng)(sheng)變化(hua)，特別是(shi)一些二倍體的無限細(xi)胞系，迅速生(sheng)(sheng)長(chang)之后容易發(fa)生(sheng)(sheng)惡性轉(zhuan)化(hua)。

關于新西蘭 胎牛血清使用中的常見問題

1.保存血清推薦的辦法？
我們(men)建(jian)議血(xue)(xue)清應保(bao)存在-5℃-20℃。若你一(yi)次無法用完(wan)一(yi)瓶，建(jian)議您無菌分裝血(xue)(xue)清恰(qia)當的滅菌容(rong)器內，再放回冷凍。

2.如何解凍血清才不會使產品質量受損？
我們建議您將血清從冷凍箱中(zhong)取(qu)出后，先置于(yu)2-8℃冰箱中(zhong)使之(zhi)溶解(jie)，然后在(zai)室溫下(xia)使之(zhi)全溶。但(dan)必(bi)須注意的是，溶解(jie)過程中(zhong)必(bi)須規則地搖晃(huang)均勻。

3.血清解凍后發現有絮狀沉淀物出現，該如何處理？
血清中沉淀物的出現有許多原因，但普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性造成的；而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解凍后，也會存在于血清中，亦是造成血清沉淀物的主要原因之一。但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質量。
若(ruo)您欲去(qu)除這些絮狀沉淀物，可以(yi)將(jiang)血清分(fen)裝無菌離(li)心管中(zhong)，以(yi)400g稍微(wei)離(li)心，上清液即可接著加入培(pei)養基內(nei)一起過(guo)(guo)濾。我們(men)不(bu)建議(yi)您以(yi)過(guo)(guo)濾的方法去(qu)除這些絮狀沉淀物，因為它可能會(hui)阻(zu)塞您的過(guo)(guo)濾膜。

4.何謂熱滅活？有必要做熱滅活嗎？
一般以56℃，30分鐘水浴來處理已解凍的血清，因為此加熱步驟，可以使補體去活性，而補體所參與的反應有：溶細胞活性，平滑肌的收縮，肥大細胞和血小板組胺的釋放，增強吞噬作用，淋巴細胞、巨噬細胞的趨化和激活。實驗顯示，經過正確處理的熱滅活血清，對大多數的細胞而言是不需要的。經過處理的血清對細胞生長只有微小的促進，或*沒有任何作用，甚通常因為高溫處理影響了血清的質量，而造成細胞生長速率的降低。
而(er)經過熱處(chu)理的血(xue)(xue)清，沉淀物(wu)的形成會(hui)顯著的增多，這(zhe)些(xie)沉淀物(wu)在(zai)倒置(zhi)顯微鏡下觀(guan)察(cha)，像(xiang)是“小黑點”，常常會(hui)讓研究者誤以為是血(xue)(xue)清遭受污染(ran)，而(er)把血(xue)(xue)清放在(zai)37℃環(huan)境中，又會(hui)使此沉淀物(wu)更(geng)增多，使研究者認為是微生物(wu)的分(fen)裂擴增。因此我們建議(yi)您(nin)(nin)，若(ruo)非必須，您(nin)(nin)可以不需要做熱滅活這(zhe)一步。如此以來，不但節省您(nin)(nin)寶(bao)貴(gui)的時間，更(geng)確保您(nin)(nin)血(xue)(xue)清的質(zhi)量！

5.如何避免沉淀物的出現？
我們(men)建議您在使用血(xue)清(qing)的時(shi)候，注意正確的血(xue)清(qing)解凍步驟，并盡量避免(mian)滅活血(xue)清(qing)及(ji)長(chang)時(shi)間的將血(xue)清(qing)置于(yu)高溫環境中。

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