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新生牛血(xue)清

新生牛血清通常作為補(bu)充成分(fen)添加(jia)在基(ji)(ji)礎培(pei)(pei)(pei)(pei)養基(ji)(ji)內使用。它能夠提供各種大(da)分(fen)子(zi)蛋白(bai)，小分(fen)子(zi)量營(ying)養，水溶(rong)性成分(fen)的(de)轉運(yun)蛋白(bai)，和其它一(yi)些細胞(bao)在體外所(suo)必(bi)需的(de)成分(fen)，如激(ji)素和附著因子(zi)。血清(qing)可以結合或中(zhong)和一(yi)些生長因子(zi)中(zhong)的(de)有(you)毒(du)成分(fen)，并提供培(pei)(pei)(pei)(pei)養基(ji)(ji)的(de)緩沖(chong)能力。細胞(bao)培(pei)(pei)(pei)(pei)養時血清(qing)的(de)添加(jia)依賴于基(ji)(ji)礎培(pei)(pei)(pei)(pei)養基(ji)(ji)的(de)化學(xue)組成，培(pei)(pei)(pei)(pei)養細胞(bao)的(de)類型，及所(suo)用的(de)培(pei)(pei)(pei)(pei)養系統。

我們(men)(men)在(zai)提供(gong)細胞(bao)培養基、平衡鹽溶液(ye)、無血(xue)清(qing)培養基和試劑的(de)同時，還提供(gong)高品(pin)(pin)質(zhi)的(de)血(xue)清(qing)。我們(men)(men)對(dui)血(xue)清(qing)制備進行全過(guo)程(cheng)(cheng)監管。從血(xue)清(qing)收集到終(zhong)產品(pin)(pin)檢驗和內部(bu)稽核的(de)每(mei)一個步驟(zou)，我們(men)(men)都采用設備和標準操作程(cheng)(cheng)序，以(yi)確(que)保(bao)整個過(guo)程(cheng)(cheng)中(zhong)每(mei)個環節的(de)產品(pin)(pin)質(zhi)量(liang)。對(dui)整個過(guo)程(cheng)(cheng)的(de)控(kong)制可以(yi)保(bao)證(zheng)產品(pin)(pin)的(de)持(chi)續高品(pin)(pin)質(zhi)，降低不(bu)同批次的(de)差異。

處理：全部血(xue)(xue)(xue)清(qing)：收集的(de)(de)血(xue)(xue)(xue)液均(jun)在冷藏條件下處理。血(xue)(xue)(xue)清(qing)和血(xue)(xue)(xue)塊分離后立即(ji)將血(xue)(xue)(xue)清(qing)合并(bing)(bing)并(bing)(bing)冷凍。只有符合我們(men)的(de)(de)檢測(ce)標準的(de)(de)血(xue)(xue)(xue)清(qing)才被接受作進一步(bu)處理。

熱滅活血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)：熱滅活是在(zai)56℃水(shui)浴中(zhong)嚴格控溫30分鐘。透析(xi)血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)：用10,000截留分子量的(de)(de)(de)(de)透析(xi)膜在(zai)0.15M的(de)(de)(de)(de)NaCl中(zhong)進(jin)行(xing)透析(xi)，直到葡萄糖(tang)水(shui)平低于(yu)5mg/dl(用鄰甲苯胺測試(shi)法(fa)檢驗)。γ射(she)線照(zhao)射(she)血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)：可按客戶要求對血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)進(jin)行(xing)γ射(she)線照(zhao)射(she)。通(tong)過(guo)(guo)γ射(she)線照(zhao)射(she)以滅活各種(zhong)動物血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(包括(kuo)胎牛(niu)血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)、、豬(zhu)血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)和(he)馬血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing))中(zhong)的(de)(de)(de)(de)病(bing)毒和(he)支原體的(de)(de)(de)(de)方法(fa)已經(jing)得到證(zheng)實(shi)。研究(jiu)證(zheng)實(shi)照(zhao)射(she)劑(ji)量在(zai)30-45kGy為(wei)(wei)宜。血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)在(zai)此照(zhao)射(she)后(hou)物理化學特性(xing)和(he)細(xi)胞培養表現沒有變化。裝瓶：粗血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)須通(tong)過(guo)(guo)一系列的(de)(de)(de)(de)過(guo)(guo)濾(lv)(lv)(lv)才成(cheng)為(wei)(wei)成(cheng)品(pin)(pin)。后(hou)的(de)(de)(de)(de)過(guo)(guo)濾(lv)(lv)(lv)步(bu)驟包括(kuo)使用0.2um和(he)0.1um的(de)(de)(de)(de)無菌過(guo)(guo)濾(lv)(lv)(lv)。胎牛(niu)血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)須通(tong)過(guo)(guo)三次(ci)0.1um過(guo)(guo)濾(lv)(lv)(lv)，其他(ta)血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)須通(tong)過(guo)(guo)0.2um過(guo)(guo)濾(lv)(lv)(lv)。終(zhong)產(chan)品(pin)(pin)的(de)(de)(de)(de)質量控制：我們(men)采取以下(xia)方法(fa)對每一批次(ci)的(de)(de)(de)(de)產(chan)品(pin)(pin)選取一定數量的(de)(de)(de)(de)樣品(pin)(pin)進(jin)行(xing)質量控制分析(xi)：

化學(xue)檢測(ce)：使(shi)(shi)用低溫凝固點的方法檢測(ce)滲(shen)透壓(ya)，以保證符(fu)合產品(pin)規范。我們每天使(shi)(shi)用國(guo)家(jia)標(biao)(biao)(biao)準(zhun)的技(ji)術(shu)研(yan)究所(suo)標(biao)(biao)(biao)定的標(biao)(biao)(biao)準(zhun)溶(rong)液(ye)對我們的滲(shen)透壓(ya)檢測(ce)儀器進(jin)行(xing)(xing)校準(zhun)。同樣每天使(shi)(shi)用國(guo)家(jia)標(biao)(biao)(biao)準(zhun)技(ji)術(shu)研(yan)究所(suo)標(biao)(biao)(biao)定的標(biao)(biao)(biao)準(zhun)溶(rong)液(ye)對pH計進(jin)行(xing)(xing)校準(zhun)。

使(shi)用(yong)電泳(yong)圖譜(pu)鑒定血(xue)(xue)清的(de)整體(ti)(ti)性質。樣品被轉移到硝(xiao)酸(suan)纖(xian)維素(su)基(ji)質中(zhong)，并在緩沖體(ti)(ti)系(xi)內(nei)遷移。條(tiao)帶(dai)經染色、清潔、干(gan)燥后(hou)用(yong)密度儀進(jin)(jin)行掃描，以檢(jian)測白蛋(dan)白和球(qiu)蛋(dan)白組分的(de)相對濃度。為證實是否在適當的(de)條(tiao)件下(xia)進(jin)(jin)行采血(xue)(xue)和處理，使(shi)用(yong)修飾的(de)Fleming方法對血(xue)(xue)紅蛋(dan)白進(jin)(jin)行分光光度檢(jian)測。

隨著(zhu)動(dong)(dong)(dong)物年(nian)齡的(de)增加，血(xue)清總蛋(dan)(dan)白(bai)含(han)量(liang)也(ye)相(xiang)應(ying)地(di)提高。使(shi)用(yong)自動(dong)(dong)(dong)化(hua)的(de)Biuret方法(fa)進行總血(xue)清蛋(dan)(dan)白(bai)的(de)檢測，以確(que)認(ren)動(dong)(dong)(dong)物年(nian)齡并(bing)驗證符合(he)產品規范。使(shi)用(yong)色(se)度計(ji)在不同波長下檢測樣品和Biuret試劑混合(he)波的(de)吸光度。自動(dong)(dong)(dong)計(ji)算結果后，與標準曲線比較，即(ji)可得到蛋(dan)(dan)白(bai)值(克/公(gong)升)。

穩定性(xing)(xing)檢(jian)測程(cheng)序(xu)(xu)：在每一個(ge)標(biao)記為體外診斷的(de)產品(pin)上顯示的(de)效(xiao)期表明了(le)這個(ge)產品(pin)具(ju)有(you)多長時(shi)間(jian)的(de)效(xiao)能。我(wo)們的(de)穩定性(xing)(xing)程(cheng)序(xu)(xu)確(que)定和證明了(le)產品(pin)效(xiao)期。我(wo)們定期監測批量產品(pin)，確(que)定產品(pin)在推薦(jian)貯存條(tiao)件下具(ju)有(you)可(ke)接受效(xiao)果(guo)的(de)時(shi)間(jian)長度。

微生物(wu)學檢(jian)測：所有(you)血(xue)清(qing)使用Barile&Kern的(de)(de)(de)大(da)體(ti)積方(fang)法(fa)檢(jian)測支(zhi)原(yuan)體(ti)。在(zai)(zai)推薦方(fang)法(fa)的(de)(de)(de)檢(jian)測范(fan)圍內檢(jian)測結(jie)果是準確的(de)(de)(de)。樣(yang)品少應該在(zai)(zai)肉湯中(zhong)合并培養3個星期，同時要在(zai)(zai)瓊(qiong)脂平(ping)(ping)板(ban)上進行(xing)不(bu)少于4次(ci)傳代(dai)培養。在(zai)(zai)有(you)氧(yang)和厭(yan)氧(yang)(95%氮，5%CO2)條件下(xia)，平(ping)(ping)板(ban)在(zai)(zai)36±2℃下(xia)孵(fu)育。在(zai)(zai)檢(jian)測過程中(zhong)，每周對瓊(qiong)脂平(ping)(ping)板(ban)進行(xing)一(yi)次(ci)微生物(wu)生長情況檢(jian)驗。使用Dienes染色(se)(se)法(fa)對懷(huai)疑被污(wu)染的(de)(de)(de)瓊(qiong)脂平(ping)(ping)板(ban)進行(xing)支(zhi)原(yuan)體(ti)菌落的(de)(de)(de)檢(jian)測。然(ran)后(hou)，對平(ping)(ping)板(ban)進行(xing)再次(ci)鏡檢(jian)。對孵(fu)育肉湯瓶要定期進行(xing)濁度和pH值(zhi)變動的(de)(de)(de)檢(jian)測。在(zai)(zai)推薦方(fang)法(fa)檢(jian)測范(fan)圍內，所有(you)血(xue)清(qing)也要使用Hoechst熒光DNA染色(se)(se)法(fa)進行(xing)不(bu)可在(zai)(zai)肉湯中(zhong)培養的(de)(de)(de)支(zhi)原(yuan)體(ti)(包括(kuo)M.hyorhinis屬)檢(jian)測。

病(bing)(bing)(bing)毒檢(jian)測：已知(zhi)無外來物質(zhi)(zhi)的(de)細胞(bao)培養(yang)基(ji)須經過在包含15%測試血(xue)(xue)清(qing)的(de)生長培養(yang)基(ji)中進(jin)行為期21天(tian)(tian)的(de)三次傳(chuan)代培養(yang)。使用對照培養(yang)基(ji)和已知(zhi)對外來物質(zhi)(zhi)為陰性的(de)血(xue)(xue)清(qing)平行地維持陰性對照培養(yang)。整個期間，檢(jian)測所有(you)的(de)培養(yang)情況，以(yi)便發現(xian)是(shi)否存在病(bing)(bing)(bing)毒誘發的(de)細胞(bao)形態(tai)改變或(huo)致細胞(bao)病(bing)(bing)(bing)變效(xiao)應。在1421天(tian)(tian)的(de)培養(yang)期間，對含有(you)檢(jian)測血(xue)(xue)清(qing)的(de)平行培養(yang)瓶(ping)按下(xia)面標準病(bing)(bing)(bing)毒檢(jian)測方法進(jin)行評估。

將其(qi)中一(yi)瓶檢(jian)測(ce)細(xi)胞(bao)用胰蛋白(bai)酶消(xiao)化，然后把細(xi)胞(bao)分別加入到總(zong)面積為6cm 2 的(de)六室載(zai)玻(bo)(bo)(bo)片(pian)(pian)上。同時準(zhun)備陰性(xing)(xing)對照載(zai)玻(bo)(bo)(bo)片(pian)(pian)。在(zai)檢(jian)測(ce)培養(yang)的(de)單室載(zai)玻(bo)(bo)(bo)片(pian)(pian)上加入牛(niu)病(bing)(bing)(bing)毒性(xing)(xing)腹瀉病(bing)(bing)(bing)毒(BVDV)、牛(niu)細(xi)小病(bing)(bing)(bing)毒、牛(niu)腺病(bing)(bing)(bing)毒、狂犬病(bing)(bing)(bing)毒和呼腸病(bing)(bing)(bing)毒的(de)染色劑，作為單個的(de)陽性(xing)(xing)對照。再經過7天(tian)培養(yang)(總(zong)共(gong)21天(tian))，利(li)用熒光抗體技術檢(jian)測(ce)病(bing)(bing)(bing)毒。

通過對檢(jian)測培養進行蘇(su)木精伊(yi)紅染(ran)色，觀察致(zhi)細胞突變效(xiao)應(CPE)或其他病毒誘導效(xiao)應。檢(jian)測細胞是(shi)否(fou)存在CPE效(xiao)應、內(nei)含物、多核體(ti)或其他異常效(xiao)應。

內毒素(su)檢測(ce)(ce)：我(wo)們用(yong)阿米巴變(bian)形細(xi)胞溶解物(wu)(LAL)凝膠(jiao)法來(lai)檢測(ce)(ce)胎牛血清的內毒素(su)含量。

效能檢測：
對(dui)每(mei)一批(pi)次的(de)(de)胎牛血(xue)(xue)清(qing)，我(wo)們(men)都進(jin)行下述培(pei)養效(xiao)能(neng)檢測。選擇血(xue)(xue)清(qing)重要的(de)(de)標準是其支持特殊細(xi)胞的(de)(de)生(sheng)長(chang)能(neng)力。因此，除了(le)保(bao)證血(xue)(xue)清(qing)通過嚴格(ge)的(de)(de)品質控制(zhi)，我(wo)們(men)也同(tong)時(shi)在實驗室(shi)條件下對(dui)血(xue)(xue)清(qing)的(de)(de)三個重要的(de)(de)培(pei)養效(xiao)能(neng)進(jin)行檢測：克(ke)隆效(xiao)率、貼壁(bi)效(xiao)果(guo)和二倍體成纖(xian)維細(xi)胞生(sheng)長(chang)促進(jin)。

克隆效率分析：克隆效率實驗分析每一批胎牛血清促進小鼠骨髓瘤細胞及其衍生的雜交瘤細胞的克隆和生長能力。下列產品
經驗證可用于該實驗：
Sp2/0-Ag14(ATCC #CRL 1581)
P3x63-Ag8.653(ATCC #CRL 1580)

每一(yi)(yi)批胎牛血(xue)清(qing)都要分別在復制微量滴(di)定平板上加(jia)入兩(liang)(liang)種血(xue)清(qing)濃(nong)(nong)度和(he)(he)兩(liang)(liang)種細胞(bao)接種量(10%血(xue)清(qing)和(he)(he)1cell/孔，4%血(xue)清(qing)和(he)(he)5cells/孔)的(de)(de)情況下進行分析(xi)。克隆分析(xi)結果除以已(yi)確定的(de)(de)參照血(xue)清(qing)值得以歸(gui)一(yi)(yi)化(hua)。在許(xu)多日常雜(za)交選(xuan)擇(ze)(ze)程序中具(ju)有代表性的(de)(de)是高(gao)濃(nong)(nong)度的(de)(de)血(xue)清(qing)，而低濃(nong)(nong)度血(xue)清(qing)在設計(ji)血(xue)清(qing)批次(ci)(ci)細微差異(yi)放大(da)檢測(ce)中有更為嚴格的(de)(de)測(ce)試。嚴格的(de)(de)1cell/孔測(ce)試是模擬單一(yi)(yi)雜(za)交選(xuan)擇(ze)(ze)的(de)(de)實驗室條(tiao)件(jian)。為每一(yi)(yi)批次(ci)(ci)胎牛血(xue)清(qing)提供(gong)的(de)(de)分析(xi)證明報告中的(de)(de)克隆效(xiao)率值為兩(liang)(liang)次(ci)(ci)測(ce)試條(tiao)件(jian)下的(de)(de)平均值。

克隆分析法：克隆分析法是在復式96孔板中加入兩種胎牛血清濃度(10%v/v)和(4%v/v)和兩種接種量的情況下進行的。每一次化驗中，同時測量前期已驗證合格的一批胎牛血清，并將此測量值作為內部參考標準。
克隆(long)分析(xi)按下述方法進(jin)行：

1．Sp2/0-Ag14(sp2)和(he)P3x63-Ag8.653(653)在含(han)有(you)10%的(de)胎牛血清的(de)RPM1640中通常(chang)保持對(dui)數生長期。在顯微鏡下，利用臺盼藍排除法對(dui)活細胞(bao)進行計(ji)數。

2．用RPM1640培養基(ji)將儲備細胞(bao)懸浮(fu)液進行連續(xu)稀(xi)釋，使其達到預期(qi)的(de)(de)(de)(de)25cells/ml和5cells/ml接種(zhong)濃度。準備含(han)有參照或測試胎牛血清的(de)(de)(de)(de)RPM1640培養基(ji)。將這種(zhong)密度的(de)(de)(de)(de)細胞(bao)分(fen)配到各個(ge)分(fen)析生長培養基(ji)體積為0.2毫(hao)升的(de)(de)(de)(de)孔中(zhong)，使其分(fen)別平均含(han)有5個(ge)和1個(ge)細胞(bao)。

3．將96孔(kong)板(ban)放入36±2℃，4-6% CO 2 的潮濕培養箱(xiang)孵育約(yue)1015天。

4．在孵(fu)育(yu)期間，用肉眼觀(guan)察平(ping)板并對用于(yu)克(ke)隆(long)的孔進行計數。克(ke)隆(long)效率按下列方法計算(suan)：克(ke)隆(long)效率=(陽性孔平(ping)均數/孵(fu)育(yu)孔總數)×100%

5．每一批(pi)次(ci)胎牛(niu)血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)維(wei)持指示劑骨(gu)髓瘤細胞(bao)克(ke)隆效(xiao)率(lv)的(de)定量按照(zhao)以(yi)(yi)下(xia)方(fang)法(fa)測得的(de)相(xiang)對克(ke)隆效(xiao)率(lv)(RCE)進行歸一化：RCE=檢測血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)的(de)克(ke)隆效(xiao)率(lv)/對照(zhao)血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)的(de)克(ke)隆效(xiao)率(lv)貼壁效(xiao)率(lv)分(fen)析：貼壁效(xiao)率(lv)分(fen)析是(shi)利用已轉型的(de)人(ren)類細胞(bao)系來檢測每一批(pi)血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)促使持續貼附(fu)細胞(bao)系的(de)生長能(neng)力(li)。選擇已被驗證(zheng)可以(yi)(yi)檢測貼壁效(xiao)率(lv)的(de)細胞(bao)系A549(人(ren)肺腫瘤細胞(bao)，ATCC#CCL,185)，是(shi)因為它可以(yi)(yi)區分(fen)一批(pi)血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)維(wei)持細胞(bao)貼壁和繁殖能(neng)力(li)的(de)細微差異。

每一批次(ci)胎牛血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)都要在兩(liang)種血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)濃度和(he)兩(liang)種細胞接(jie)種濃度下(10%血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)和(he)100cells/孔(kong)，4%血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)和(he)200cells/孔(kong))測試(shi)三次(ci)。在36±2℃，4-6% CO 2 的(de)(de)潮濕培養箱孵育約(yue)1014天(tian)，對(dui)被染(ran)色的(de)(de)細胞菌落進(jin)行計(ji)數(shu)即可(ke)得(de)到(dao)其貼壁(bi)效率(lv)(lv)。將結果除以(yi)(yi)參(can)考(kao)的(de)(de)對(dui)照(zhao)血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)得(de)以(yi)(yi)歸一化。通(tong)過兩(liang)種血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)濃度的(de)(de)測試(shi)，可(ke)以(yi)(yi)驗證(zheng)(zheng)該批次(ci)血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)在減量和(he)標(biao)準水平下維持生(sheng)長的(de)(de)能力。為(wei)每一批次(ci)胎牛血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)提(ti)供的(de)(de)分析證(zheng)(zheng)明(ming)報告中(zhong)的(de)(de)貼壁(bi)效率(lv)(lv)值為(wei)兩(liang)次(ci)測試(shi)條件下的(de)(de)平均(jun)值。

貼(tie)壁分(fen)析(xi)法：使用(yong)貼(tie)附分(fen)析(xi)檢(jian)測上述每(mei)(mei)(mei)一(yi)批測試血(xue)(xue)清。這種(zhong)分(fen)析(xi)法針(zhen)對每(mei)(mei)(mei)一(yi)個(ge)血(xue)(xue)清樣品使用(yong)一(yi)個(ge)6孔(kong)(kong)板(ban)(每(mei)(mei)(mei)室9.6cm 2 )，并可以對三個(ge)孔(kong)(kong)的(de)(de)數(shu)據進行平(ping)均處理。每(mei)(mei)(mei)一(yi)次(ci)化驗中，同時測量前(qian)期已驗證合格(ge)的(de)(de)一(yi)批胎(tai)牛血(xue)(xue)清，并將此測量值(zhi)作為內部(bu)參考(kao)標準。

貼附(fu)分(fen)析按(an)下述方法進行：

1．A549細胞系用含有10%胎牛(niu)血(xue)清的(de)DMEM培(pei)(pei)養基(ji)，在36±2℃，以亞(ya)融合密(mi)度下進行培(pei)(pei)養。

2．含10%(v/v)和4%(v/v)血清(qing)(qing)的DMEM由分別在22.5毫升(sheng)和24毫升(sheng)DMEM中加入(ru)2.5毫升(sheng)和1毫升(sheng)胎牛血清(qing)(qing)配制而成(cheng)，終(zhong)有效體積為25毫升(sheng)。將5毫升(sheng)含血清(qing)(qing)培(pei)養基(ji)分別加入(ru)6孔板(ban)的每一(yi)個孔中。

3．A549培養細(xi)胞先(xian)經過(guo)胰蛋白(bai)酶消化，測定活細(xi)胞數，然后稀釋細(xi)胞懸浮液2,000cells/ml。

4．將0.1毫(hao)(hao)升細(xi)胞懸(xuan)浮液(ye)加入200cells/孔室(shi)中，0.05毫(hao)(hao)升懸(xuan)浮液(ye)加入100cells/孔室(shi)中。平(ping)板混合后放入36±2℃，5%CO 2 的潮濕培養(yang)箱孵育約1014天。

5．孵育后，取出(chu)平板，去除生長培(pei)養(yang)基，用亞甲(jia)基蘭-甲(jia)醇溶液對菌(jun)落進行(xing)染色。

6．計(ji)算菌落形成，然后(hou)按(an)下述方法計(ji)算貼壁效率(lv)：%貼壁效率(lv)=每(mei)孔菌落平均數/每(mei)孔孵(fu)育(yu)活細(xi)胞平均數×100

7．為方便比較，將測得的(de)(de)貼(tie)壁效(xiao)率(lv)(lv)數值除以每(mei)批(pi)檢(jian)測血(xue)清(qing)的(de)(de)相對貼(tie)壁效(xiao)率(lv)(lv)(RPE)得以歸(gui)一化(hua)：RCE=檢(jian)測血(xue)清(qing)的(de)(de)貼(tie)壁效(xiao)率(lv)(lv)/參照血(xue)清(qing)的(de)(de)貼(tie)壁效(xiao)率(lv)(lv)二倍體成纖維(wei)細胞生長(chang)：促進生長(chang)分析用于(yu)檢(jian)測每(mei)一批(pi)胎(tai)牛(niu)血(xue)清(qing)維(wei)持難(nan)培養的(de)(de)人(ren)二倍體成纖維(wei)細胞長(chang)期生長(chang)的(de)(de)能力。

下(xia)列細胞系經認證可用于該實(shi)驗：

WI-38(人二倍(bei)體肺成纖維細胞，ATCC#CCL 75)

WI-38細胞(bao)(bao)在(zai)含5%胎牛血(xue)清(qing)的(de)(de)低密度(du)(2X10 5 /瓶)復式25-cm 2瓶中孵(fu)育，并進(jin)行為(wei)期三個連(lian)續(xu)7天(tian)的(de)(de)傳代(dai)培(pei)(pei)(pei)(pei)養。在(zai)每(mei)一(yi)個培(pei)(pei)(pei)(pei)養期，細胞(bao)(bao)都從(cong)初始孵(fu)育密度(du)開(kai)始傳代(dai)培(pei)(pei)(pei)(pei)養。壓力(li)分層率、成倍(bei)繁殖數量和減量血(xue)清(qing)濃度(du)是每(mei)批次(ci)(ci)促進(jin)難培(pei)(pei)(pei)(pei)養二(er)倍(bei)體(ti)細胞(bao)(bao)的(de)(de)生(sheng)長血(xue)清(qing)的(de)(de)嚴(yan)格測(ce)試指標。通(tong)過連(lian)續(xu)三代(dai)培(pei)(pei)(pei)(pei)養以(yi)減少(shao)前(qian)一(yi)次(ci)(ci)生(sheng)長培(pei)(pei)(pei)(pei)養基的(de)(de)殘留影響，從(cong)而保(bao)證得(de)到檢(jian)測(ce)批促進(jin)生(sheng)長能力(li)的(de)(de)真實結果。為(wei)每(mei)一(yi)批次(ci)(ci)胎牛血(xue)清(qing)提供的(de)(de)分析(xi)證明報(bao)告為(wei)第(di)三次(ci)(ci)傳代(dai)培(pei)(pei)(pei)(pei)養每(mei)復式培(pei)(pei)(pei)(pei)養瓶細胞(bao)(bao)數的(de)(de)平均值。將檢(jian)測(ce)值除以(yi)參考對(dui)照值得(de)以(yi)歸(gui)一(yi)化(hua)。

二倍體成纖(xian)維細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)生長分(fen)析法：培養數代(dai)WI-38人類二倍體肺成纖(xian)維細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)，計算每(mei)一代(dai)的(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)總(zong)數。此項檢測所(suo)挑選(xuan)出的(de)(de)(de)胎牛血清批號能維持難以(yi)生長細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)、貼(tie)壁性細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)、正常的(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)株(zhu)生長及存(cun)活。

1．準備含5%檢(jian)測(ce)血清或已(yi)驗證合(he)格(ge)的參(can)照(zhao)血清生長(chang)培養(yang)基，基礎生長(chang)培養(yang)基為含L-谷氨酰胺的HBME：EBME(1：1)。按要(yao)求，在每(mei)一次流(liu)量變化和分析(xi)過程中(zhong)進(jin)行傳代培養(yang)時需配制(zhi)含5%血清生長(chang)的培養(yang)基。

2．在(zai)低代培養(yang)(yang)水平時(shi)，將(jiang)2X10 5 WI-38細胞加入(ru)各個(ge)含(han)9.5毫(hao)升(sheng)生長培養(yang)(yang)基的(de)復式25-cm 2 培養(yang)(yang)基中(zhong)。在(zai)不擰緊(jin)瓶(ping)蓋(gai)的(de)情況(kuang)下(xia)，將(jiang)培養(yang)(yang)瓶(ping)放入(ru)4-6%CO 2， 36℃±2℃環境中(zhong)，保持(chi)24小(xiao)時(shi)。然后擰緊(jin)瓶(ping)蓋(gai)，將(jiang)培養(yang)(yang)瓶(ping)放在(zai)36℃±2℃下(xia)孵育(yu)7天，在(zai)第(di)2天或第(di)3天全部更換培養(yang)(yang)基。

3．在第(di)7天(tian)，用胰蛋白酶對每一個含(han)參(can)照(zhao)或檢測(ce)血清(qing)的(de)(de)復式瓶中的(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)進(jin)行消化得(de)到(dao)一定數(shu)量(liang)細(xi)胞(bao)(bao)，然后(hou)合并(bing)并(bing)計數(shu)。將2x10 5 WI-38細(xi)胞(bao)(bao)加(jia)入含(han)有新鮮生長培(pei)(pei)養基(已加(jia)入了與上一代(dai)(dai)同一批次的(de)(de)參(can)照(zhao)或檢測(ce)胎(tai)牛血清(qing))的(de)(de)新的(de)(de)復式25-cm 2 瓶中，進(jin)行細(xi)胞(bao)(bao)傳代(dai)(dai)培(pei)(pei)養。按第(di)2步(bu)所(suo)述，將培(pei)(pei)養瓶進(jin)行平(ping)衡并(bing)孵(fu)育。

4．如上所述(shu)經過三(san)代連續分析，在每一(yi)代結束時(shi)計算每一(yi)批參(can)照(zhao)或檢(jian)測(ce)血清(qing)的(de)每瓶細胞平(ping)均數(shu)。后一(yi)代培(pei)養的(de)各批檢(jian)測(ce)血清(qing)實(shi)驗(yan)中的(de)相對生長率(RGR)作為參(can)照(zhao)血清(qing)實(shi)驗(yan)中獲得的(de)細胞生長率分子：

%RGR=檢測血清(qing)(qing)實(shi)驗(yan)中每瓶平(ping)均(jun)細胞數/參照血清(qing)(qing)實(shi)驗(yan)中每瓶平(ping)均(jun)細胞數X100S f9細胞生長(chang)促進分(fen)析(xi)。通過(guo)昆蟲(chong)分(fen)析(xi)可(ke)以(yi)保證您購買的胎牛血清(qing)(qing)批次可(ke)以(yi)維持S f9細胞的生長(chang)。收到產品(pin)后，您需要做的就是混勻血清(qing)(qing)，在56℃下熱滅活30分(fen)鐘。這種分(fen)析(xi)法也可(ke)以(yi)用于(yu)(yu)乳白(bai)蛋(dan)白(bai)水解產品(pin)、酵(jiao)母(mu)和其它生長(chang)輔料(liao)作為原料(liao)的生物效能分(fen)析(xi)。該(gai)分(fen)析(xi)法的準(zhun)確性取決(jue)于(yu)(yu)是否用常規的細胞培(pei)養方(fang)案(an)進行培(pei)養。用臺盼藍染色(se)排除法測得(de)的細胞活性少不(bu)低于(yu)(yu)80%。

細胞生長分析法。

1．使用含10%檢測或(huo)參(can)照熱(re)滅活胎(tai)牛(niu)血清的已驗證的Grace昆明培(pei)(pei)養(yang)基配制(zhi)*檢測培(pei)(pei)養(yang)基。

2．將儲備(bei)Sf9細胞加入50毫升離心管(guan)(guan)中，在50Xg下離心5分鐘。然后將每支試管(guan)(guan)的沉淀物(wu)重新用含(han)10%的檢測或參照熱滅活胎牛血(xue)清*培養基配制成懸浮液。

3．反試管顛倒幾(ji)次(ci)，然后每支試管倒出1毫(hao)升樣品。用臺盼藍染色(se)排除進行活細胞計(ji)數。

4．如果活(huo)性≥80%，把試管(guan)再顛倒幾次并取(qu)出0.25毫升樣(yang)品。然(ran)后用Coulter計數(shu)器進(jin)行細胞計數(shu)。

5．將(jiang)細(xi)(xi)胞(bao)加入Erlenmeyer瓶中，使(shi)其終細(xi)(xi)胞(bao)濃度為2.75X10 5 cells/ml。孵育后，再一(yi)次進行細(xi)(xi)胞(bao)計數(shu)，以保證細(xi)(xi)胞(bao)密(mi)度為2.5X10 5 3.0X10 5 cells/ml。

6．將培養(yang)瓶(ping)放到搖(yao)床(chuang)上，在(zai)27℃±1℃、80-90rpm條(tiao)件下孵育(yu)96小時。

7．從每一培(pei)養瓶(ping)中分別取(qu)(qu)出0.25毫升(sheng)樣(yang)品(pin)，用Coulter計(ji)數器進行計(ji)數。同時取(qu)(qu)出一定量的樣(yang)品(pin)進行細(xi)胞活性檢(jian)測。

8．將檢測(ce)細胞密度(du)與參照(zhao)細胞密度(du)相比(bi)即可得到相對細胞密度(du)(RCN)。

噬(shi)菌體檢測:我們利用溶(rong)菌斑分(fen)析(xi)法(fa)來檢測是否存在噬(shi)菌體。從每(mei)一批血(xue)清中(zhong)取具(ju)代(dai)表性的(de)樣品(pin)加(jia)(jia)入(ru)(ru)胰蛋(dan)白酶磷(lin)酸(suan)瓊脂中(zhong)，并在其加(jia)(jia)入(ru)(ru)含有噬(shi)菌體敏感的(de)大腸桿菌懸浮液(ye)(C-3000或K-12)。然后，混合物會在胰蛋(dan)白酶磷(lin)酸(suan)瓊脂平板(ban)上分(fen)層(ceng)，在36±2℃環境下孵育約24小(xiao)時后，觀察(cha)平板(ban)上溶(rong)菌斑的(de)形態。

生化特征檢測。

血紅(hong)蛋白檢測：所有批次的胎牛血清我們都(dou)進(jin)行了(le)血紅(hong)蛋白的檢測，血紅(hong)蛋白含量(liang)低于(yu)《中(zhong)國生物制品主(zhu)要(yao)原(yuan)輔材料指(zhi)控指(zhi)標(biao)》(2000年版)公布的指(zhi)標(biao)。

效能檢測：其它血清

。檢(jian)測維(wei)持(chi)超(chao)過三代(dai)VERO細胞(bao)生長(chang)的能力。在每一個培(pei)養期(qi)，細胞(bao)都從初始孵育(yu)密度開始傳代(dai)培(pei)養。可將所得結果與使用含有已知特征的參照(zhao)血清(qing)對照(zhao)生長(chang)培(pei)養基獲(huo)得的平行結果進(jin)行比(bi)較(jiao)。

馬血清。每一批馬血清被檢測維持(chi)在(zai)含有檢測批血清的對照培養基(ji)上Sp2/0-Ag14(小鼠(shu)骨髓瘤)細胞生長(chang)的能力(li)。可將所得結果與(yu)使用(yong)含有已(yi)知特征的參照血清對照生長(chang)培養基(ji)獲得的平行(xing)結果進行(xing)比(bi)較(jiao)。

血(xue)清(qing)的使用(yong)與儲存(cun)：正(zheng)確(que)的使用(yong)及保存(cun)血(xue)清(qing)，才能使血(xue)清(qing)發揮(hui)應有(you)的作用(yong)。

1. 儲(chu)存(cun)條件(jian)：血清一般儲(chu)存(cun)于－20℃，同時(shi)應避免反復凍融。購買大包裝的血清后(hou)(hou)，先(xian)(xian)要滅活處理，然后(hou)(hou)分裝成小包裝，儲(chu)存(cun)于－20℃，使(shi)(shi)用(yong)前融化(hua)。融化(hua)時(shi)好先(xian)(xian)置(zhi)于4℃。融化(hua)后(hou)(hou)的血清在4℃不宜長時(shi)間存(cun)放，應盡快使(shi)(shi)用(yong)。

2. 使用濃(nong)度(du)：自從有(you)了合成培養基，血清(qing)就是作為(wei)一種(zhong)添加成分與合成培養基混合使用，使用濃(nong)度(du)一般為(wei)5－20％，常用是10％。過多血清(qing)容(rong)易使培養中的(de)細胞(bao)發(fa)生變化，特(te)別是一些二(er)倍體(ti)的(de)無限細胞(bao)系，迅(xun)速生長(chang)之后容(rong)易發(fa)生惡性(xing)轉(zhuan)化。

關于(yu)血清使用中的常見問題

1.保存血清好的辦法？
我們建議血清(qing)(qing)應保存在-5℃-20℃。若你一(yi)次無法用(yong)完一(yi)瓶，建議您無菌分裝血清(qing)(qing)恰當的滅菌容(rong)器內，再放(fang)回冷凍。

2.如何解凍血清才不會使產品質量受損？
我們建議您(nin)將(jiang)血清從冷凍箱中(zhong)取出后，先置(zhi)于2-8℃冰(bing)箱中(zhong)使(shi)之(zhi)溶解(jie)(jie)，然后在室(shi)溫下使(shi)之(zhi)全溶。但必(bi)須注(zhu)意的是(shi)，溶解(jie)(jie)過程中(zhong)必(bi)須規則地(di)搖晃均勻(yun)。

3.血清解凍后發現有絮狀沉淀物出現，該如何處理？
血清中沉淀物的出現有許多原因，但普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性造成的；而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解凍后，也會存在于血清中，亦是造成血清沉淀物的主要原因之一。但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質量。

若(ruo)您(nin)欲去(qu)除這些絮(xu)狀沉(chen)淀物(wu)(wu)，可以(yi)將血(xue)清(qing)(qing)分(fen)裝無菌離心(xin)管中(zhong)，以(yi)400g稍微離心(xin)，上清(qing)(qing)液(ye)即可接(jie)著加入(ru)培(pei)養(yang)基內一(yi)起(qi)過(guo)(guo)濾。我們不建(jian)議(yi)您(nin)以(yi)過(guo)(guo)濾的(de)方法去(qu)除這些絮(xu)狀沉(chen)淀物(wu)(wu)，因(yin)為它可能(neng)會阻塞您(nin)的(de)過(guo)(guo)濾膜。

4.何謂熱滅活？有必要做熱滅活嗎？
一般以56℃，30分鐘水浴來處理已解凍的血清，因為此加熱步驟，可以使補體去活性，而補體所參與的反應有：溶細胞活性，平滑肌的收縮，肥大細胞和血小板組胺的釋放，增強吞噬作用，淋巴細胞、巨噬細胞的趨化和激活。實驗顯示，經過正確處理的熱滅活血清，對大多數的細胞而言是不需要的。經過處理的血清對細胞生長只有微小的促進，或*沒有任何作用，甚通常因為高溫處理影響了血清的質量，而造成細胞生長速率的降低。

而(er)經過熱處理的(de)血(xue)清(qing)，沉(chen)淀(dian)物的(de)形成(cheng)會顯著的(de)增(zeng)多，這些沉(chen)淀(dian)物在(zai)倒(dao)置顯微(wei)鏡(jing)下觀察，像(xiang)是(shi)(shi)“小(xiao)黑點(dian)"，常(chang)常(chang)會讓研究者(zhe)(zhe)誤以為是(shi)(shi)血(xue)清(qing)遭受污(wu)染，而(er)把(ba)血(xue)清(qing)放在(zai)37℃環境(jing)中，又會使此(ci)沉(chen)淀(dian)物更增(zeng)多，使研究者(zhe)(zhe)認為是(shi)(shi)微(wei)生物的(de)分裂擴增(zeng)。因(yin)此(ci)我們建議您，若(ruo)非必須(xu)，您可以不(bu)需要做熱滅活(huo)這一步。如此(ci)以來，不(bu)但節省(sheng)您寶貴的(de)時間，更確保(bao)您血(xue)清(qing)的(de)質量(liang)！

5.如何避免沉淀物的出現？
我們建議您在使用血(xue)清(qing)的時(shi)候(hou)，注意(yi)正(zheng)確的血(xue)清(qing)解(jie)凍步驟，并盡量避(bi)免滅(mie)活血(xue)清(qing)及(ji)長(chang)時(shi)間的將血(xue)清(qing)置于高溫環(huan)境中。

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