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墨西哥血源 胎牛血清

GIBCO原裝 胎牛血清通常(chang)作為補充成分添加在(zai)基(ji)(ji)礎(chu)培(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)內使用。它能夠提(ti)供各種(zhong)大分子蛋(dan)白，小分子量(liang)營養(yang)(yang)，水溶性成分的(de)轉(zhuan)運蛋(dan)白，和(he)(he)其它一些(xie)細胞在(zai)體外(wai)所(suo)必需的(de)成分，如激(ji)素和(he)(he)附著因子。血清可以結合或(huo)中和(he)(he)一些(xie)生(sheng)長因子中的(de)有毒(du)成分，并提(ti)供培(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)的(de)緩沖(chong)能力。細胞培(pei)(pei)養(yang)(yang)時(shi)血清的(de)添加依(yi)賴(lai)于基(ji)(ji)礎(chu)培(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)的(de)化學(xue)組成，培(pei)(pei)養(yang)(yang)細胞的(de)類型，及所(suo)用的(de)培(pei)(pei)養(yang)(yang)系統。

我們(men)在提供(gong)細(xi)胞培養(yang)基、平衡鹽溶液、無(wu)血清培養(yang)基和試(shi)劑的(de)同(tong)時(shi)，還提供(gong)高品質的(de)血清。我們(men)對血清制備(bei)(bei)進行全過(guo)程(cheng)監(jian)管。從血清收集到終產(chan)品檢驗(yan)和內部稽核的(de)每(mei)一個(ge)(ge)(ge)步驟，我們(men)都采用設備(bei)(bei)和標準操作程(cheng)序，以確保整個(ge)(ge)(ge)過(guo)程(cheng)中每(mei)個(ge)(ge)(ge)環節的(de)產(chan)品質量(liang)。對整個(ge)(ge)(ge)過(guo)程(cheng)的(de)控制可(ke)以保證產(chan)品的(de)持(chi)續高品質，降低不(bu)同(tong)批次(ci)的(de)差異。

處理：全部血(xue)清(qing)(qing)：收集的血(xue)液均在冷藏條(tiao)件下(xia)處理。血(xue)清(qing)(qing)分離后立即(ji)將血(xue)清(qing)(qing)合并并冷凍。只有(you)符合我們的檢測(ce)標準的血(xue)清(qing)(qing)才被接受(shou)作進一步(bu)處理。

熱滅活血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)：熱滅活是在56℃水(shui)浴(yu)中嚴格控(kong)(kong)溫30分(fen)鐘。透(tou)析血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)：用10,000截留(liu)分(fen)子量(liang)的(de)(de)透(tou)析膜在0.15M的(de)(de)NaCl中進(jin)行透(tou)析，直到葡萄糖水(shui)平(ping)低于5mg/dl(用鄰甲(jia)苯(ben)胺測試(shi)法(fa)檢(jian)驗(yan))。γ射(she)(she)線照(zhao)射(she)(she)血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)：可按客戶要求(qiu)對血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)進(jin)行γ射(she)(she)線照(zhao)射(she)(she)。通過(guo)(guo)γ射(she)(she)線照(zhao)射(she)(she)以(yi)滅活各種動物(wu)血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(包括(kuo)胎牛(niu)血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)、新生牛(niu)血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)、豬血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)和(he)(he)馬血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing))中的(de)(de)病毒和(he)(he)支原(yuan)體的(de)(de)方(fang)法(fa)已(yi)經得到證(zheng)實。研究證(zheng)實照(zhao)射(she)(she)劑量(liang)在30-45kGy為宜。血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)在此照(zhao)射(she)(she)后(hou)物(wu)理化學特性(xing)和(he)(he)細胞培養表現沒有(you)變化。裝瓶：粗血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)須通過(guo)(guo)一(yi)系列的(de)(de)過(guo)(guo)濾(lv)才成為成品。后(hou)的(de)(de)過(guo)(guo)濾(lv)步(bu)驟包括(kuo)使用0.2um和(he)(he)0.1um的(de)(de)無菌(jun)過(guo)(guo)濾(lv)。胎牛(niu)血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)須通過(guo)(guo)三次(ci)0.1um過(guo)(guo)濾(lv)，其他(ta)血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)須通過(guo)(guo)0.2um過(guo)(guo)濾(lv)。終(zhong)產品的(de)(de)質量(liang)控(kong)(kong)制：我們(men)采(cai)取(qu)以(yi)下方(fang)法(fa)對每一(yi)批(pi)次(ci)的(de)(de)產品選取(qu)一(yi)定數量(liang)的(de)(de)樣品進(jin)行質量(liang)控(kong)(kong)制分(fen)析：

化學檢(jian)測(ce)：使用(yong)低溫凝(ning)固點(dian)的(de)方法檢(jian)測(ce)滲透(tou)壓(ya)，以保證符合(he)產品(pin)規范(fan)。我們每天(tian)使用(yong)國家(jia)標準(zhun)(zhun)的(de)技術(shu)研(yan)(yan)究所(suo)標定(ding)的(de)標準(zhun)(zhun)溶液對我們的(de)滲透(tou)壓(ya)檢(jian)測(ce)儀(yi)器(qi)進行校準(zhun)(zhun)。同(tong)樣(yang)每天(tian)使用(yong)國家(jia)標準(zhun)(zhun)技術(shu)研(yan)(yan)究所(suo)標定(ding)的(de)標準(zhun)(zhun)溶液對pH計進行校準(zhun)(zhun)。

使(shi)用電(dian)泳(yong)圖譜鑒定血清的(de)整體(ti)性質。樣(yang)品被轉(zhuan)移到硝(xiao)酸纖維素基(ji)質中，并(bing)在緩沖體(ti)系內遷移。條(tiao)(tiao)帶(dai)經染(ran)色(se)、清潔(jie)、干燥后用密度(du)儀進(jin)(jin)行掃描，以檢(jian)測白(bai)蛋(dan)白(bai)和球蛋(dan)白(bai)組分(fen)的(de)相(xiang)對濃度(du)。為證實是否在適當的(de)條(tiao)(tiao)件(jian)下(xia)進(jin)(jin)行采(cai)血和處理，使(shi)用修(xiu)飾的(de)Fleming方法對血紅蛋(dan)白(bai)進(jin)(jin)行分(fen)光光度(du)檢(jian)測。

隨著動(dong)(dong)物(wu)年齡(ling)的(de)增加，血清(qing)總蛋(dan)白含量(liang)也相應地(di)提(ti)高(gao)。使(shi)用自動(dong)(dong)化的(de)Biuret方法進(jin)行總血清(qing)蛋(dan)白的(de)檢測，以確認動(dong)(dong)物(wu)年齡(ling)并驗(yan)證符合產品(pin)規范。使(shi)用色度計在不(bu)同(tong)波長下檢測樣品(pin)和(he)Biuret試劑混合波的(de)吸(xi)光度。自動(dong)(dong)計算結果后(hou)，與標準(zhun)曲線比較，即可得到蛋(dan)白值(zhi)(克(ke)/公(gong)升(sheng))。

穩定性檢(jian)測程序：在每一個(ge)標記為體外診斷(duan)的產(chan)(chan)品(pin)上(shang)顯示的效期表明了這個(ge)產(chan)(chan)品(pin)具有(you)多長(chang)時間(jian)的效能。我(wo)們的穩定性程序確定和證明了產(chan)(chan)品(pin)效期。我(wo)們定期監(jian)測批量產(chan)(chan)品(pin)，確定產(chan)(chan)品(pin)在推薦貯存條件(jian)下具有(you)可接(jie)受(shou)效果的時間(jian)長(chang)度。

微(wei)生物(wu)學檢(jian)測(ce)：所(suo)有(you)血清使(shi)用(yong)Barile&Kern的(de)(de)(de)(de)大體(ti)(ti)積方法(fa)檢(jian)測(ce)支原體(ti)(ti)。在(zai)(zai)(zai)推(tui)薦方法(fa)的(de)(de)(de)(de)檢(jian)測(ce)范圍(wei)內檢(jian)測(ce)結果是準確的(de)(de)(de)(de)。樣品少應該在(zai)(zai)(zai)肉(rou)湯(tang)中(zhong)合并培(pei)養3個星期(qi)，同(tong)時要在(zai)(zai)(zai)瓊(qiong)脂平板上進(jin)行(xing)不少于4次傳代培(pei)養。在(zai)(zai)(zai)有(you)氧和厭氧(95%氮，5%CO2)條件下，平板在(zai)(zai)(zai)36±2℃下孵育。在(zai)(zai)(zai)檢(jian)測(ce)過程中(zhong)，每(mei)周(zhou)對(dui)瓊(qiong)脂平板進(jin)行(xing)一(yi)次微(wei)生物(wu)生長情況檢(jian)驗。使(shi)用(yong)Dienes染(ran)色法(fa)對(dui)懷疑被污染(ran)的(de)(de)(de)(de)瓊(qiong)脂平板進(jin)行(xing)支原體(ti)(ti)菌落的(de)(de)(de)(de)檢(jian)測(ce)。然后，對(dui)平板進(jin)行(xing)再(zai)次鏡檢(jian)。對(dui)孵育肉(rou)湯(tang)瓶要定期(qi)進(jin)行(xing)濁(zhuo)度和pH值變動的(de)(de)(de)(de)檢(jian)測(ce)。在(zai)(zai)(zai)推(tui)薦方法(fa)檢(jian)測(ce)范圍(wei)內，所(suo)有(you)血清也(ye)要使(shi)用(yong)Hoechst熒光DNA染(ran)色法(fa)進(jin)行(xing)不可在(zai)(zai)(zai)肉(rou)湯(tang)中(zhong)培(pei)養的(de)(de)(de)(de)支原體(ti)(ti)(包(bao)括M.hyorhinis屬(shu))檢(jian)測(ce)。

病(bing)毒檢測(ce)：已(yi)知無外來物質的(de)細胞(bao)培養(yang)(yang)基須經過在包(bao)含15%測(ce)試血(xue)清(qing)的(de)生長培養(yang)(yang)基中進(jin)行(xing)為(wei)期21天的(de)三次傳(chuan)代(dai)培養(yang)(yang)。使用對照培養(yang)(yang)基和(he)已(yi)知對外來物質為(wei)陰性(xing)的(de)血(xue)清(qing)平行(xing)地(di)維持陰性(xing)對照培養(yang)(yang)。整(zheng)個(ge)期間，檢測(ce)所有的(de)培養(yang)(yang)情況(kuang)，以便(bian)發現(xian)是否存(cun)在病(bing)毒誘發的(de)細胞(bao)形態改(gai)變或致細胞(bao)病(bing)變效(xiao)應。在1421天的(de)培養(yang)(yang)期間，對含有檢測(ce)血(xue)清(qing)的(de)平行(xing)培養(yang)(yang)瓶按下面標準病(bing)毒檢測(ce)方法(fa)進(jin)行(xing)評估。

將(jiang)其中一瓶(ping)檢(jian)測(ce)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)用(yong)胰蛋(dan)白酶消化，然后把細(xi)(xi)胞(bao)(bao)分(fen)別加(jia)入(ru)到總面積為6cm 2 的六室(shi)載(zai)玻片上(shang)。同時(shi)準備陰性(xing)對(dui)照(zhao)載(zai)玻片。在檢(jian)測(ce)培養(yang)的單室(shi)載(zai)玻片上(shang)加(jia)入(ru)牛病毒性(xing)腹(fu)瀉病毒(BVDV)、牛細(xi)(xi)小病毒、牛腺病毒、狂犬病毒和(he)呼腸病毒的染色劑，作為單個的陽性(xing)對(dui)照(zhao)。再經過7天培養(yang)(總共21天)，利(li)用(yong)熒光抗體技(ji)術檢(jian)測(ce)病毒。

通過對檢測培(pei)養進行蘇(su)木精伊紅染(ran)色，觀察致細(xi)胞(bao)突(tu)變效應(ying)(ying)(CPE)或其(qi)他病毒誘導效應(ying)(ying)。檢測細(xi)胞(bao)是否存在CPE效應(ying)(ying)、內含物、多核體或其(qi)他異(yi)常效應(ying)(ying)。

內毒素檢測(ce)：我們用阿米巴變形細胞溶解物(LAL)凝(ning)膠法(fa)來(lai)檢測(ce)胎(tai)牛(niu)血清的內毒素含(han)量。

效能檢測：
對每一批(pi)次的(de)胎牛(niu)血清，我(wo)們都(dou)進行下(xia)述培(pei)養效能(neng)檢測。選(xuan)擇血清重(zhong)(zhong)要(yao)的(de)標(biao)準是其支持特殊細胞的(de)生(sheng)長能(neng)力。因(yin)此(ci)，除(chu)了保證血清通過嚴格的(de)品質控(kong)制，我(wo)們也同時在實(shi)驗室條件下(xia)對血清的(de)三個(ge)重(zhong)(zhong)要(yao)的(de)培(pei)養效能(neng)進行檢測：克隆效率(lv)、貼(tie)壁(bi)效果和二倍體成纖維細胞生(sheng)長促進。

克隆效率分析：克隆效率實驗分析每一批胎牛血清促進小鼠骨髓瘤細胞及其衍生的雜交瘤細胞的克隆和生長能力。下列產品
經驗證可用于該實驗：
Sp2/0-Ag14(ATCC #CRL 1581)
P3x63-Ag8.653(ATCC #CRL 1580)

每一(yi)批(pi)胎牛血(xue)(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)都要分(fen)(fen)別(bie)在(zai)復制微量(liang)滴(di)定平板上加入兩種(zhong)血(xue)(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)濃(nong)度和兩種(zhong)細胞接種(zhong)量(liang)(10%血(xue)(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)和1cell/孔(kong)，4%血(xue)(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)和5cells/孔(kong))的(de)(de)情(qing)況下(xia)進行分(fen)(fen)析(xi)(xi)。克(ke)(ke)隆分(fen)(fen)析(xi)(xi)結果除以(yi)(yi)已(yi)確定的(de)(de)參照血(xue)(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)值(zhi)得以(yi)(yi)歸一(yi)化。在(zai)許(xu)多日常雜(za)交(jiao)選(xuan)擇程序中(zhong)具有(you)代(dai)表性的(de)(de)是(shi)高濃(nong)度的(de)(de)血(xue)(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)，而低濃(nong)度血(xue)(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)在(zai)設(she)計血(xue)(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)批(pi)次(ci)細微差(cha)異放大(da)檢(jian)測中(zhong)有(you)更為嚴格的(de)(de)測試(shi)。嚴格的(de)(de)1cell/孔(kong)測試(shi)是(shi)模(mo)擬單一(yi)雜(za)交(jiao)選(xuan)擇的(de)(de)實驗室條件。為每一(yi)批(pi)次(ci)胎牛血(xue)(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)提(ti)供的(de)(de)分(fen)(fen)析(xi)(xi)證明報告中(zhong)的(de)(de)克(ke)(ke)隆效率值(zhi)為兩次(ci)測試(shi)條件下(xia)的(de)(de)平均值(zhi)。

克隆分析法：克隆分析法是在復式96孔板中加入兩種胎牛血清濃度(10%v/v)和(4%v/v)和兩種接種量的情況下進行的。每一次化驗中，同時測量前期已驗證合格的一批胎牛血清，并將此測量值作為內部參考標準。
克(ke)隆分析按下述方法進(jin)行：

1．Sp2/0-Ag14(sp2)和P3x63-Ag8.653(653)在含有(you)10%的胎(tai)牛血(xue)清的RPM1640中通常保持對數(shu)(shu)生長(chang)期。在顯微鏡(jing)下，利(li)用臺盼藍排除法對活細胞進行(xing)計數(shu)(shu)。

2．用RPM1640培(pei)養(yang)基(ji)將儲備細胞(bao)(bao)(bao)懸浮液進(jin)行連續稀釋(shi)，使其達到(dao)(dao)預期的25cells/ml和5cells/ml接(jie)種濃(nong)度。準(zhun)備含有參照或測試胎牛血(xue)清的RPM1640培(pei)養(yang)基(ji)。將這種密(mi)度的細胞(bao)(bao)(bao)分(fen)配到(dao)(dao)各個分(fen)析生(sheng)長培(pei)養(yang)基(ji)體積為0.2毫(hao)升(sheng)的孔中，使其分(fen)別平(ping)均(jun)含有5個和1個細胞(bao)(bao)(bao)。

3．將96孔板放(fang)入36±2℃，4-6% CO 2 的潮濕培養箱孵育約1015天。

4．在孵(fu)育(yu)期間，用肉(rou)眼觀察平(ping)板并對用于克隆的(de)孔(kong)進行計(ji)數。克隆效率按下列方(fang)法計(ji)算：克隆效率=(陽(yang)性孔(kong)平(ping)均數/孵(fu)育(yu)孔(kong)總(zong)數)×100%

5．每(mei)一批次(ci)胎牛血(xue)清(qing)(qing)維持指示劑(ji)骨髓瘤細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)克(ke)隆(long)效(xiao)率(lv)的(de)(de)(de)(de)定量(liang)按(an)照(zhao)以下方(fang)法測(ce)(ce)得的(de)(de)(de)(de)相對克(ke)隆(long)效(xiao)率(lv)(RCE)進行歸一化：RCE=檢(jian)測(ce)(ce)血(xue)清(qing)(qing)的(de)(de)(de)(de)克(ke)隆(long)效(xiao)率(lv)/對照(zhao)血(xue)清(qing)(qing)的(de)(de)(de)(de)克(ke)隆(long)效(xiao)率(lv)貼(tie)壁效(xiao)率(lv)分(fen)析：貼(tie)壁效(xiao)率(lv)分(fen)析是利用已(yi)轉型的(de)(de)(de)(de)人(ren)(ren)類細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)系(xi)來檢(jian)測(ce)(ce)每(mei)一批血(xue)清(qing)(qing)促使持續貼(tie)附細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)系(xi)的(de)(de)(de)(de)生長能力。選擇已(yi)被(bei)驗證可以檢(jian)測(ce)(ce)貼(tie)壁效(xiao)率(lv)的(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)系(xi)A549(人(ren)(ren)肺腫瘤細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，ATCC#CCL,185)，是因為(wei)它可以區分(fen)一批血(xue)清(qing)(qing)維持細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)貼(tie)壁和(he)繁殖能力的(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)微差異。

每一批(pi)次(ci)(ci)胎牛(niu)血(xue)清(qing)(qing)(qing)都要在(zai)兩(liang)種血(xue)清(qing)(qing)(qing)濃度(du)(du)和(he)兩(liang)種細胞接種濃度(du)(du)下(xia)(xia)(10%血(xue)清(qing)(qing)(qing)和(he)100cells/孔，4%血(xue)清(qing)(qing)(qing)和(he)200cells/孔)測(ce)試(shi)三次(ci)(ci)。在(zai)36±2℃，4-6% CO 2 的(de)潮濕培養箱孵育(yu)約1014天，對被染色的(de)細胞菌落進(jin)行計數即(ji)可得(de)到其(qi)貼(tie)壁效率(lv)。將(jiang)結果除(chu)以(yi)參考的(de)對照血(xue)清(qing)(qing)(qing)得(de)以(yi)歸(gui)一化。通過兩(liang)種血(xue)清(qing)(qing)(qing)濃度(du)(du)的(de)測(ce)試(shi)，可以(yi)驗證該批(pi)次(ci)(ci)血(xue)清(qing)(qing)(qing)在(zai)減量和(he)標準水平(ping)下(xia)(xia)維持生長的(de)能力(li)。為每一批(pi)次(ci)(ci)胎牛(niu)血(xue)清(qing)(qing)(qing)提供的(de)分析證明(ming)報告中的(de)貼(tie)壁效率(lv)值為兩(liang)次(ci)(ci)測(ce)試(shi)條件下(xia)(xia)的(de)平(ping)均值。

貼壁分析(xi)法(fa)：使(shi)用(yong)貼附分析(xi)檢(jian)測(ce)上(shang)述每(mei)(mei)一(yi)(yi)(yi)批測(ce)試血(xue)清(qing)(qing)。這種分析(xi)法(fa)針(zhen)對每(mei)(mei)一(yi)(yi)(yi)個血(xue)清(qing)(qing)樣品使(shi)用(yong)一(yi)(yi)(yi)個6孔板(每(mei)(mei)室9.6cm 2 )，并可以對三個孔的(de)(de)數據進(jin)行平均(jun)處理。每(mei)(mei)一(yi)(yi)(yi)次化驗中，同時測(ce)量前期(qi)已驗證合格(ge)的(de)(de)一(yi)(yi)(yi)批胎牛血(xue)清(qing)(qing)，并將此測(ce)量值(zhi)作(zuo)為(wei)內部(bu)參考標準(zhun)。

貼附分析按(an)下述方法進行：

1．A549細(xi)胞系(xi)用含有10%胎(tai)牛血清的DMEM培養基(ji)，在36±2℃，以亞融合密度下進行(xing)培養。

2．含10%(v/v)和(he)4%(v/v)血清的DMEM由(you)分(fen)別在22.5毫升(sheng)和(he)24毫升(sheng)DMEM中(zhong)加入2.5毫升(sheng)和(he)1毫升(sheng)胎牛血清配制而成，終(zhong)有效(xiao)體積為25毫升(sheng)。將5毫升(sheng)含血清培養基分(fen)別加入6孔板的每一(yi)個(ge)孔中(zhong)。

3．A549培養(yang)細胞(bao)(bao)先(xian)經過胰蛋白酶(mei)消(xiao)化，測(ce)定活細胞(bao)(bao)數，然后稀釋細胞(bao)(bao)懸(xuan)浮液2,000cells/ml。

4．將0.1毫升(sheng)細胞懸(xuan)浮液加入(ru)200cells/孔室中(zhong)，0.05毫升(sheng)懸(xuan)浮液加入(ru)100cells/孔室中(zhong)。平板混(hun)合后放入(ru)36±2℃，5%CO 2 的潮濕(shi)培(pei)養箱孵(fu)育約1014天。

5．孵育后，取(qu)出平(ping)板，去除生(sheng)長培(pei)養基，用亞甲基蘭(lan)-甲醇(chun)溶液對菌(jun)落進行(xing)染(ran)色。

6．計(ji)算(suan)菌落形成(cheng)，然后(hou)按(an)下述方法計(ji)算(suan)貼壁效(xiao)率：%貼壁效(xiao)率=每孔菌落平(ping)均數/每孔孵育活細(xi)胞平(ping)均數×100

7．為方便比較(jiao)，將(jiang)測得的(de)(de)貼(tie)(tie)壁(bi)效(xiao)率(lv)(lv)數值(zhi)除以每(mei)批(pi)檢測血(xue)清(qing)(qing)的(de)(de)相對貼(tie)(tie)壁(bi)效(xiao)率(lv)(lv)(RPE)得以歸一(yi)化：RCE=檢測血(xue)清(qing)(qing)的(de)(de)貼(tie)(tie)壁(bi)效(xiao)率(lv)(lv)/參照(zhao)血(xue)清(qing)(qing)的(de)(de)貼(tie)(tie)壁(bi)效(xiao)率(lv)(lv)二(er)倍(bei)體(ti)成纖(xian)維細胞生(sheng)長(chang)：促進生(sheng)長(chang)分析(xi)用于(yu)檢測每(mei)一(yi)批(pi)胎牛血(xue)清(qing)(qing)維持(chi)難培養的(de)(de)人二(er)倍(bei)體(ti)成纖(xian)維細胞長(chang)期生(sheng)長(chang)的(de)(de)能力。

下列細胞系經(jing)認證可用于該實驗：

WI-38(人二倍體肺成纖維細胞(bao)，ATCC#CCL 75)

WI-38細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)在含5%胎牛血清(qing)(qing)的低密(mi)度(2X10 5 /瓶(ping)(ping))復(fu)式25-cm 2瓶(ping)(ping)中孵(fu)育(yu)，并進行(xing)為(wei)期三(san)(san)個(ge)連(lian)續(xu)7天的傳(chuan)(chuan)代(dai)(dai)培(pei)(pei)養(yang)。在每(mei)一個(ge)培(pei)(pei)養(yang)期，細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)都從(cong)初始孵(fu)育(yu)密(mi)度開始傳(chuan)(chuan)代(dai)(dai)培(pei)(pei)養(yang)。壓力分層(ceng)率、成倍繁殖數(shu)量和減(jian)量血清(qing)(qing)濃度是每(mei)批次促進難培(pei)(pei)養(yang)二倍體細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的生長血清(qing)(qing)的嚴(yan)格測試指標。通過連(lian)續(xu)三(san)(san)代(dai)(dai)培(pei)(pei)養(yang)以減(jian)少前一次生長培(pei)(pei)養(yang)基(ji)的殘留影響，從(cong)而保證得到(dao)檢測批促進生長能力的真實結果(guo)。為(wei)每(mei)一批次胎牛血清(qing)(qing)提供(gong)的分析證明報告為(wei)第三(san)(san)次傳(chuan)(chuan)代(dai)(dai)培(pei)(pei)養(yang)每(mei)復(fu)式培(pei)(pei)養(yang)瓶(ping)(ping)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)數(shu)的平均值。將(jiang)檢測值除以參考對照值得以歸一化。

二倍(bei)體成纖維細胞(bao)(bao)生長(chang)(chang)分(fen)析法：培養數(shu)代(dai)WI-38人類二倍(bei)體肺成纖維細胞(bao)(bao)，計算每一(yi)代(dai)的細胞(bao)(bao)總數(shu)。此項檢測所挑選出的胎牛(niu)血清批號能維持難(nan)以生長(chang)(chang)細胞(bao)(bao)、貼壁性細胞(bao)(bao)、正(zheng)常的細胞(bao)(bao)株生長(chang)(chang)及存活。

1．準(zhun)備含5%檢測血(xue)清或已驗證(zheng)合格的參(can)照血(xue)清生長(chang)培養基，基礎(chu)生長(chang)培養基為含L-谷氨酰胺的HBME：EBME(1：1)。按要求，在每一次流量變化(hua)和分(fen)析過程中(zhong)進行傳代培養時(shi)需配制含5%血(xue)清生長(chang)的培養基。

2．在低代(dai)培養(yang)水平時，將(jiang)2X10 5 WI-38細(xi)胞(bao)加入各個含9.5毫升(sheng)生長培養(yang)基的復(fu)式25-cm 2 培養(yang)基中。在不擰緊(jin)瓶(ping)蓋(gai)的情況下，將(jiang)培養(yang)瓶(ping)放(fang)入4-6%CO 2， 36℃±2℃環境中，保(bao)持24小(xiao)時。然后擰緊(jin)瓶(ping)蓋(gai)，將(jiang)培養(yang)瓶(ping)放(fang)在36℃±2℃下孵育7天，在第(di)2天或(huo)第(di)3天全部更換培養(yang)基。

3．在第(di)7天，用(yong)胰蛋白酶對每一個含(han)參照(zhao)或檢測血清的(de)(de)復式(shi)瓶中的(de)(de)細胞(bao)進(jin)行消(xiao)化得到一定數量細胞(bao)，然(ran)后合并(bing)并(bing)計數。將2x10 5 WI-38細胞(bao)加入(ru)含(han)有(you)新鮮生長培養(yang)基(ji)(已加入(ru)了與上一代(dai)同(tong)一批(pi)次的(de)(de)參照(zhao)或檢測胎牛血清)的(de)(de)新的(de)(de)復式(shi)25-cm 2 瓶中，進(jin)行細胞(bao)傳代(dai)培養(yang)。按第(di)2步所述，將培養(yang)瓶進(jin)行平(ping)衡并(bing)孵育。

4．如上所述經過(guo)三代連續分(fen)析，在每一代結束時(shi)計算每一批參照或檢測血清(qing)的(de)每瓶細(xi)胞(bao)平(ping)均數。后一代培(pei)養的(de)各批檢測血清(qing)實(shi)驗中(zhong)的(de)相(xiang)對生長率(lv)(RGR)作(zuo)為參照血清(qing)實(shi)驗中(zhong)獲得的(de)細(xi)胞(bao)生長率(lv)分(fen)子：

%RGR=檢(jian)測(ce)血清實驗中每(mei)瓶平(ping)均細(xi)胞(bao)數(shu)/參照血清實驗中每(mei)瓶平(ping)均細(xi)胞(bao)數(shu)X100S f9細(xi)胞(bao)生長促進分(fen)析(xi)。通(tong)過昆蟲分(fen)析(xi)可(ke)以(yi)保證(zheng)您(nin)購買的(de)(de)胎牛血清批次可(ke)以(yi)維持(chi)S f9細(xi)胞(bao)的(de)(de)生長。收到產品(pin)后(hou)，您(nin)需(xu)要做的(de)(de)就是混勻血清，在56℃下(xia)熱滅活(huo)30分(fen)鐘。這種分(fen)析(xi)法(fa)(fa)也可(ke)以(yi)用于(yu)乳(ru)白蛋白水解(jie)產品(pin)、酵母和其它生長輔(fu)料作為原料的(de)(de)生物效(xiao)能分(fen)析(xi)。該分(fen)析(xi)法(fa)(fa)的(de)(de)準確(que)性取決于(yu)是否用常規的(de)(de)細(xi)胞(bao)培(pei)養方案進行培(pei)養。用臺盼藍染(ran)色排除法(fa)(fa)測(ce)得的(de)(de)細(xi)胞(bao)活(huo)性少不(bu)低于(yu)80%。

細胞生長分析法。

1．使用含10%檢(jian)測或參(can)照熱滅活胎牛(niu)血清的(de)已驗證的(de)Grace昆明培養(yang)基配(pei)制*檢(jian)測培養(yang)基。

2．將(jiang)儲備Sf9細胞(bao)加入50毫升離心管(guan)中，在50Xg下(xia)離心5分鐘。然后將(jiang)每支試管(guan)的沉淀(dian)物重新(xin)用含10%的檢測或參照(zhao)熱滅(mie)活胎牛血清*培(pei)養基配制(zhi)成(cheng)懸(xuan)浮液。

3．反試管顛倒(dao)幾(ji)次，然后每支試管倒(dao)出1毫升樣品。用(yong)臺盼藍染色排除進行活細胞(bao)計數。

4．如果活性≥80%，把試管(guan)再顛倒幾次并取出0.25毫升樣品。然(ran)后用(yong)Coulter計(ji)數器進(jin)行細胞計(ji)數。

5．將細(xi)胞(bao)(bao)(bao)加入(ru)Erlenmeyer瓶(ping)中，使(shi)其終細(xi)胞(bao)(bao)(bao)濃度(du)為(wei)2.75X10 5 cells/ml。孵育后(hou)，再一次進行(xing)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)計數，以(yi)保證細(xi)胞(bao)(bao)(bao)密度(du)為(wei)2.5X10 5 3.0X10 5 cells/ml。

6．將培養(yang)瓶放到搖床上(shang)，在27℃±1℃、80-90rpm條件(jian)下(xia)孵育96小時(shi)。

7．從每一(yi)培養瓶中分別取(qu)出(chu)0.25毫升樣品，用Coulter計(ji)數器進行計(ji)數。同時取(qu)出(chu)一(yi)定量(liang)的樣品進行細胞活性(xing)檢測。

8．將檢測(ce)細胞密(mi)(mi)度與參照細胞密(mi)(mi)度相比即可(ke)得到(dao)相對細胞密(mi)(mi)度(RCN)。

噬菌(jun)體檢(jian)測(ce):我們利用溶(rong)菌(jun)斑分析法來檢(jian)測(ce)是否存在噬菌(jun)體。從每一批血清中取具(ju)代表性的(de)樣品加(jia)(jia)入胰蛋(dan)白(bai)酶(mei)磷酸瓊(qiong)脂(zhi)中，并在其加(jia)(jia)入含有噬菌(jun)體敏感(gan)的(de)大腸桿菌(jun)懸浮(fu)液(C-3000或K-12)。然后(hou)，混合物會在胰蛋(dan)白(bai)酶(mei)磷酸瓊(qiong)脂(zhi)平板上分層，在36±2℃環境下孵育約24小時后(hou)，觀察平板上溶(rong)菌(jun)斑的(de)形態。

生化特征檢測。

血紅蛋(dan)白(bai)檢測：所有批次的(de)胎牛血清我們都進行(xing)了血紅蛋(dan)白(bai)的(de)檢測，血紅蛋(dan)白(bai)含量低于《中國生物制品(pin)主要原輔材料指(zhi)(zhi)控指(zhi)(zhi)標(biao)》(2000年版)公布的(de)指(zhi)(zhi)標(biao)。

效能檢測：其它血清

新(xin)生(sheng)牛血(xue)(xue)清(qing)。檢(jian)測新(xin)生(sheng)牛血(xue)(xue)清(qing)維持(chi)超過三代(dai)VERO細胞生(sheng)長的能力。在每一個(ge)培養期，細胞都從初始孵育密度開始傳(chuan)代(dai)培養。可(ke)將所得結(jie)果(guo)與(yu)使用含有已(yi)知特征的參照血(xue)(xue)清(qing)對照生(sheng)長培養基獲得的平(ping)行結(jie)果(guo)進行比較。

馬(ma)血清。每一批馬(ma)血清被檢測維持(chi)在含有(you)檢測批血清的(de)對照(zhao)培養基(ji)上Sp2/0-Ag14(小鼠骨髓(sui)瘤)細(xi)胞生(sheng)長(chang)的(de)能力。可(ke)將(jiang)所得(de)(de)結果與(yu)使用(yong)含有(you)已知特征的(de)參(can)照(zhao)血清對照(zhao)生(sheng)長(chang)培養基(ji)獲(huo)得(de)(de)的(de)平行結果進行比較。

GIBCO原裝 胎牛血清的(de)(de)使用與儲存(cun)：正(zheng)確的(de)(de)使用及保存(cun)血清，才(cai)能使血清發揮應(ying)有的(de)(de)作用。

1. 儲(chu)存條件(jian)：血(xue)清一般(ban)儲(chu)存于(yu)－20℃，同(tong)時應(ying)避免(mian)反復凍(dong)融(rong)。購買大包裝的(de)血(xue)清后，先要(yao)滅(mie)活處(chu)理(li)，然后分(fen)裝成(cheng)小包裝，儲(chu)存于(yu)－20℃，使用前融(rong)化。融(rong)化時推(tui)薦先置于(yu)4℃。融(rong)化后的(de)血(xue)清在(zai)4℃不宜長時間存放，應(ying)盡快使用。

2. 使用濃(nong)度：自從有了合(he)(he)成培養基，血清就是作為一種添加成分與合(he)(he)成培養基混合(he)(he)使用，使用濃(nong)度一般為5－20％，常用是10％。過多血清容易使培養中的細(xi)(xi)胞發(fa)生(sheng)變(bian)化，特別是一些二倍體的無限細(xi)(xi)胞系，迅速生(sheng)長之(zhi)后容易發(fa)生(sheng)惡性轉化。

關于血清使用中的(de)常見(jian)問(wen)題

1.保存血清推薦的辦法？
我們建(jian)議血(xue)清應保(bao)存(cun)在-5℃-20℃。若(ruo)你一次(ci)無(wu)法用完一瓶，建(jian)議您無(wu)菌分裝(zhuang)血(xue)清恰當的滅菌容器內，再放回冷凍(dong)。

2.如何解凍血清才不會使產品質量受損？
我們建議(yi)您將血清從冷凍箱中(zhong)取(qu)出后，先置于2-8℃冰(bing)箱中(zhong)使之溶(rong)(rong)解(jie)，然后在(zai)室(shi)溫下使之全溶(rong)(rong)。但(dan)必須(xu)注(zhu)意的是(shi)，溶(rong)(rong)解(jie)過程(cheng)中(zhong)必須(xu)規則地搖晃均勻(yun)。

3.血清解凍后發現有絮狀沉淀物出現，該如何處理？
血清中沉淀物的出現有許多原因，但普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性造成的；而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解凍后，也會存在于血清中，亦是造成血清沉淀物的主要原因之一。但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質量。
若您(nin)欲去(qu)除(chu)這(zhe)些(xie)(xie)絮狀(zhuang)沉淀物，可以將(jiang)血清分裝無菌離心(xin)管中，以400g稍微離心(xin)，上(shang)清液(ye)即可接著加入培養基(ji)內一(yi)起(qi)過濾(lv)。我們不建(jian)議您(nin)以過濾(lv)的方(fang)法去(qu)除(chu)這(zhe)些(xie)(xie)絮狀(zhuang)沉淀物，因(yin)為它(ta)可能(neng)會阻(zu)塞您(nin)的過濾(lv)膜。

4.何謂熱滅活？有必要做熱滅活嗎？
一般以56℃，30分鐘水浴來處理已解凍的血清，因為此加熱步驟，可以使補體去活性，而補體所參與的反應有：溶細胞活性，平滑肌的收縮，肥大細胞和血小板組胺的釋放，增強吞噬作用，淋巴細胞、巨噬細胞的趨化和激活。實驗顯示，經過正確處理的熱滅活血清，對大多數的細胞而言是不需要的。經過處理的血清對細胞生長只有微小的促進，或*沒有任何作用，甚通常因為高溫處理影響了血清的質量，而造成細胞生長速率的降低。
而經過(guo)熱處(chu)理的(de)血(xue)清，沉淀(dian)(dian)物(wu)的(de)形成會(hui)(hui)顯著的(de)增多，這(zhe)些沉淀(dian)(dian)物(wu)在倒(dao)置顯微鏡下觀察，像是(shi)(shi)“小黑點”，常(chang)常(chang)會(hui)(hui)讓研(yan)究者誤以(yi)為是(shi)(shi)血(xue)清遭受污(wu)染，而把血(xue)清放在37℃環境中，又會(hui)(hui)使(shi)此沉淀(dian)(dian)物(wu)更增多，使(shi)研(yan)究者認為是(shi)(shi)微生物(wu)的(de)分裂擴增。因(yin)此我們(men)建議您，若非必須(xu)，您可以(yi)不(bu)需(xu)要做(zuo)熱滅活這(zhe)一步(bu)。如此以(yi)來(lai)，不(bu)但節(jie)省您寶貴的(de)時(shi)間(jian)，更確保您血(xue)清的(de)質量(liang)！

5.如何避免沉淀物的出現？
我們建(jian)議您在(zai)使用血清(qing)(qing)(qing)的(de)時候，注意正確(que)的(de)血清(qing)(qing)(qing)解凍步驟，并盡量避(bi)免滅活(huo)血清(qing)(qing)(qing)及長時間的(de)將血清(qing)(qing)(qing)置于高溫環(huan)境(jing)中(zhong)。

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