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豬外周血單核細胞分離液試劑盒
貨號：P5270
規格：2×200ml/KIT
保(bao)存 ：室溫避光儲(chu)存，有效(xiao)期少(shao) 2 年。

豬外周血單核細胞分離液試劑盒

操(cao)作步驟： 1. 取新鮮(xian)抗凝全血(xue)（EDTA、枸櫞酸鈉或(huo)肝素抗凝血(xue)均可）或(huo)者(zhe)去纖(xian)維蛋白(bai)(bai)血(xue)液(ye)(ye)(ye)(ye)，用等體積的(de)(de)(de)(de)(de)(de)全血(xue)及組織(zhi)稀釋(shi)(shi)(shi)液(ye)(ye)(ye)(ye)或(huo)者(zhe)PBS稀釋(shi)(shi)(shi)全血(xue)。 2. 取一支無菌離(li)(li)心(xin)(xin)管，先加(jia)入(ru)(ru)試(shi)劑(ji)(ji)A，再加(jia)入(ru)(ru)試(shi)劑(ji)(ji)D，使兩者(zhe)形成(cheng)梯度界面(mian)（試(shi)劑(ji)(ji)A：試(shi)劑(ji)(ji)D的(de)(de)(de)(de)(de)(de)體積比為(wei)(wei)(wei)3：2，如稀釋(shi)(shi)(shi)后(hou)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)血(xue)液(ye)(ye)(ye)(ye)樣(yang)本(ben)小于5ml，則(ze)先后(hou)加(jia)入(ru)(ru)3ml試(shi)劑(ji)(ji)A和(he)2ml試(shi)劑(ji)(ji)D；如稀釋(shi)(shi)(shi)后(hou)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)血(xue)液(ye)(ye)(ye)(ye)樣(yang)本(ben)大(da)于5ml，試(shi)劑(ji)(ji)總量與(yu)稀釋(shi)(shi)(shi)后(hou)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)血(xue)液(ye)(ye)(ye)(ye)樣(yang)本(ben)量相等），兩種試(shi)劑(ji)(ji)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)分層(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)一定要(yao)清(qing)(qing)晰。 3. 將(jiang)(jiang)稀釋(shi)(shi)(shi)后(hou)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)血(xue)液(ye)(ye)(ye)(ye)平(ping)鋪到分離(li)(li)液(ye)(ye)(ye)(ye)液(ye)(ye)(ye)(ye)面(mian)上(shang)(shang)方(fang)，注意保持兩液(ye)(ye)(ye)(ye)面(mian)界面(mian)清(qing)(qing)晰。（可以(yi)使用巴(ba)(ba)氏德吸管吸取血(xue)液(ye)(ye)(ye)(ye)，然(ran)后(hou)將(jiang)(jiang)血(xue)液(ye)(ye)(ye)(ye)小心(xin)(xin)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)平(ping)鋪于分離(li)(li)液(ye)(ye)(ye)(ye)上(shang)(shang)，因為(wei)(wei)(wei)兩者(zhe)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)密度差異(yi)，將(jiang)(jiang)形成(cheng)明顯的(de)(de)(de)(de)(de)(de)分層(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)界面(mian)。如果樣(yang)品較多，加(jia)樣(yang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)時(shi)間(jian)較長(chang)，在離(li)(li)心(xin)(xin)之前出(chu)現紅細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)成(cheng)團下沉屬(shu)正常現象(xiang)） 4. 室溫，水平(ping)轉子(zi)500~800g，離(li)(li)心(xin)(xin)20~30min（血(xue)液(ye)(ye)(ye)(ye)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)體積越大(da)所需的(de)(de)(de)(de)(de)(de)離(li)(li)心(xin)(xin)力(li)越大(da)，離(li)(li)心(xin)(xin)時(shi)間(jian)越長(chang)，分離(li)(li)條件需自(zi)行摸索，離(li)(li)心(xin)(xin)轉速不超過1000g）。 5. 離(li)(li)心(xin)(xin)后(hou)將(jiang)(jiang)出(chu)現明顯的(de)(de)(de)(de)(de)(de)分層(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)： 層(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)為(wei)(wei)(wei)血(xue)漿(jiang)層(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)；第(di)(di)(di)二(er)層(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)為(wei)(wei)(wei)白(bai)(bai)色單核細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)層(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)；第(di)(di)(di)三層(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)為(wei)(wei)(wei)透(tou)明試(shi)劑(ji)(ji)D液(ye)(ye)(ye)(ye)層(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)；第(di)(di)(di)四層(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)為(wei)(wei)(wei)半透(tou)明試(shi)劑(ji)(ji)A液(ye)(ye)(ye)(ye)層(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)；第(di)(di)(di)五層(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)為(wei)(wei)(wei)紅細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)層(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)（如圖示）。 6. 小心(xin)(xin)吸取第(di)(di)(di)二(er)層(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)試(shi)劑(ji)(ji)D層(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)和(he)第(di)(di)(di)三層(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)乳白(bai)(bai)色細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)層(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)到另一無菌的(de)(de)(de)(de)(de)(de)15ml離(li)(li)心(xin)(xin)管中(zhong)，加(jia)入(ru)(ru)10mL細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)洗(xi)滌液(ye)(ye)(ye)(ye)或(huo)PBS，顛倒混(hun)勻(yun)，250g，離(li)(li)心(xin)(xin)10min。 7. 棄上(shang)(shang)清(qing)(qing)，5mL的(de)(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)清(qing)(qing)洗(xi)液(ye)(ye)(ye)(ye)或(huo)PBS重(zhong)懸細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)，250g，離(li)(li)心(xin)(xin)10min。 8. 重(zhong)復步驟7 9. 棄上(shang)(shang)清(qing)(qing)，細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)重(zhong)懸備用。 10. 差異(yi)貼(tie)(tie)壁法(fa)純(chun)化細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)：用單核細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)培(pei)養基以(yi)10 6個/ml的(de)(de)(de)(de)(de)(de)密度重(zhong)懸細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)，將(jiang)(jiang)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)鋪于細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)板或(huo)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)瓶中(zhong)，置于細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)培(pei)養箱中(zhong)進(jin)行貼(tie)(tie)壁培(pei)養。 1) 2~4 h內(nei)貼(tie)(tie)壁的(de)(de)(de)(de)(de)(de)為(wei)(wei)(wei)單核細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)。 2) 10~24 h內(nei)貼(tie)(tie)壁的(de)(de)(de)(de)(de)(de)單個核細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)為(wei)(wei)(wei)內(nei)皮、內(nei)皮祖細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)、干細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao) 。 3) 不貼(tie)(tie)壁的(de)(de)(de)(de)(de)(de)為(wei)(wei)(wei)淋巴(ba)(ba)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)。根據不同細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)貼(tie)(tie)壁時(shi)間(jian)存(cun)在差異(yi)，以(yi)達到簡單純(chun)化單核細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)目的(de)(de)(de)(de)(de)(de)。此法(fa)成(cheng)本(ben)低(di)，操(cao)作簡便(bian)。如需獲得高純(chun)度的(de)(de)(de)(de)(de)(de)目的(de)(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)則(ze)需選(xuan)用免疫磁珠分選(xuan)或(huo)者(zhe)是應用流式(shi)技(ji)術分選(xuan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)。