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Mouse IL-6 ELISA KIT目       錄

背景介紹………………………………………………………………………………

檢測原理………………………………………………………………………………

注意事項(xiang)………………………………………………………………………………

安全提示(shi)………………………………………………………………………………

試劑盒組成及儲存……………………………………………………………………

自備實驗器材…………………………………………………………………………

樣品收集及儲存(cun)………………………………………………………………………

試劑準備………………………………………………………………………………

檢測步(bu)驟………………………………………………………………………………

結果判斷………………………………………………………………………………

參數表征………………………………………………………………………………

參(can)考(kao)文獻(xian)………………………………………………………………………………

常(chang)見問(wen)題分析及解決辦(ban)法……………………………………………………………

Mouse IL-6 ELISA KIT背景介紹：

白細胞介素-6（IL-6）是由(you)纖維母(mu)細(xi)胞(bao)、單核/巨噬細(xi)胞(bao)、T淋巴(ba)細(xi)胞(bao)、B淋巴(ba)細(xi)胞(bao)、上皮細(xi)胞(bao)、角質細(xi)胞(bao)、以及多種瘤(liu)細(xi)胞(bao)所產生。IL-1、TNF-a, PDGF、病毒感(gan)染、雙鏈RNA及c AMP等，均可誘導(dao)正(zheng)常細(xi)胞(bao)產生白介素6。白介素6能(neng)夠刺激參與免疫反(fan)應(ying)的(de)細(xi)胞增殖、分(fen)化并提高其功(gong)能(neng)。IL-6由2條(tiao)糖蛋(dan)白(bai)鏈(lian)(lian)組成；1條(tiao)為(wei)α鏈(lian)(lian)，分(fen)子量80KD；另1條(tiao)為(wei)β鏈(lian)(lian)，分(fen)子量130KD。α鏈(lian)(lian)缺少胞內區，只(zhi)能(neng)以低親合(he)性(xing)與(yu)IL-6結合(he)，所形成的(de)復合(he)物迅(xun)即(ji)與(yu)高親和性(xing)的(de)β鏈(lian)(lian)結合(he)，通過β鏈(lian)(lian)向(xiang)細(xi)胞內傳遞信息。IL-6主要(yao)有以下(xia)生物特(te)性(xing)：誘導B細(xi)胞分(fen)化(hua)；支(zhi)持漿細胞(bao)瘤和骨(gu)髓瘤增生；誘導IL-2和IL-2受體表達(da)；誘導單核細(xi)胞(bao)分(fen)化(hua)；誘導(dao)CTL；增強NK細(xi)胞(bao)活(huo)性；誘導(dao)急性期(qi)反(fan)應分(fen)子并刺(ci)激(ji)肝細(xi)胞(bao)；誘導(dao)神經元(yuan)分化；誘導腎小球(qiu)膜細胞生長(chang)；誘導角質化細胞生長(chang)。

檢測原理：

    Solarbio (Solarbio ®)ELISA試(shi)劑盒(he)采用(yong)基于雙(shuang)抗體夾心(xin)法(fa)的(de)酶聯免疫吸附檢測(ce)技術。將(jiang)抗小鼠IL-6單克隆抗體包被(bei)在酶標(biao)(biao)板上(shang)；分別加入梯度稀釋(shi)的(de)標(biao)(biao)準品和(he)預稀釋(shi)的(de)樣(yang)本(ben)，標(biao)(biao)準品和(he)樣(yang)本(ben)中的(de)小(xiao)鼠IL-6會與酶(mei)標板(ban)上的包被抗體充分結(jie)合；洗板后加(jia)入生物素化抗小鼠IL-6抗體，該抗體會(hui)與板子上包被抗體捕獲的標準品和樣本中的小鼠IL-6發生特(te)異性結合；洗板后加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的鏈霉親和素，生物素與鏈霉親和素會發生高強度的(de)非共價結合；洗板(ban)后加(jia)入顯(xian)色劑底(di)物TMB，若(ruo)反應孔中樣品存在(zai)不同(tong)濃度的小(xiao)鼠IL-6，則HRP會使(shi)無色(se)TMB變(bian)成(cheng)(cheng)不同深淺（正(zheng)相關）的藍色(se)物質，加入終止液后反應孔(kong)會變(bian)成(cheng)(cheng)黃色(se)；后，在λmax=450 nm（OD=450 nm）處測定反應(ying)孔樣品吸(xi)光(guang)度（OD），樣(yang)本中的(de)小鼠IL-6濃度與OD成正比，通過繪制(zhi)標(biao)準(zhun)曲線和四參數擬合(he)軟(ruan)件(jian)便可(ke)計算(suan)出(chu)樣本中(zhong)小鼠(shu)IL-6的(de)濃度。

注意事項：※※※

1. 試劑盒應在有(you)效期(qi)內使用(yong)，請(qing)不要使用(yong)過期(qi)的試劑。

2. 試劑盒未使(shi)用時(shi)應保存(cun)在2-8℃冰箱，已復溶(rong)但(dan)未用完的標準品，請丟棄。

3. 試(shi)劑盒使(shi)用前(qian)請在室溫恢(hui)復30 min，且(qie)充分(fen)混(hun)勻試劑(ji)盒里的各種成份及(ji)制備(bei)的(de)樣品。

4. 在試驗中(zhong)標(biao)準品和樣本建議作復孔檢測(ce)，且加入試劑的順序應保持(chi)*。

5. 為避免交叉污染，請在試驗中使用1次性試管，槍頭，封板膜（※）及潔凈塑料容器。.

6. 濃縮生物素(su)化抗(kang)體和濃縮酶結合物的體積較少，在(zai)運輸過程中微量液體會沾到(dao)管壁(bi)及瓶 

蓋上(shang)，使(shi)用前(qian)請(qing)離心處理（5-10 S即可），使(shi)管(guan)壁上(shang)的液(ye)體集中在(zai)管(guan)底部(bu)，取用時，請(qing)用移液(ye)器小(xiao)心吹打幾次。

7. 除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外，請不要使用其他來源試劑盒內含的 試劑代替本試劑盒中的某單個組分。

8. 為保證結果準確，每次(ci)檢測均需做標(biao)準(zhun)曲線。

安全提示：試劑盒(he)中的終(zhong)止液為酸(suan)性溶液，操作人員在使用時請(qing)帶上手套(tao)并注(zhu)意防護；在操(cao)作過(guo)程中也要避免試劑接觸(chu)皮膚(fu)和眼睛，如果(guo)不慎接觸(chu)，請用大量清(qing)水(shui)清(qing)洗；檢測血(xue)液(ye)樣本及其它體液(ye)樣本時，請按國家生物實驗室安(an)全防護(hu)有關(guan)管理規(gui)定執行。

試劑盒組成及儲存：

自備實驗器材（不提供，可代購）

1． 酶(mei)標儀（主波長450nm，參考波長630nm）

2． 高精(jing)度移液器及(ji)一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl

3． 洗板(ban)機或洗瓶

4． 37℃孵育箱

5． 雙蒸水，去離(li)子水，量筒等

6． 稀釋用(yong)聚丙烯試管

樣本收集及儲存：

1. 細胞(bao)培養上清：

將細胞培養基(ji)移(yi)無菌離心管，在4℃條件(jian)下1000×g離心10 min,然(ran)后將上(shang)清等量分(fen)裝于(yu)小EP管并于(yu)-20℃下保存（24小時(shi)內檢測可放入2-8℃儲存），避免(mian)反復凍融。

2. 血清樣本：

室溫血液自然凝固20 min后，在4℃條(tiao)件(jian)下1000×g離心10 min，然后將上清(qing)等(deng)量(liang)分裝于小(xiao)EP管(guan)并于-20℃下保存(cun)（24小時內(nei)檢測可放入(ru)2-8℃儲存(cun)），保存(cun)過程中如有沉淀，請再(zai)次(ci)離心，避免反復凍(dong)融。

3. 血漿樣本：

將全血收集到(dao)含抗(kang)血凝(ning)劑的(de)管中，根據標本的(de)實際要求選(xuan)擇EDTA，檸檬酸鈉或肝素(su)作為(wei)抗(kang)凝(ning)劑，混(hun)合20 min，在4℃條件下(xia)1000×g離心(xin)10 min，然后(hou)將上清等量分裝(zhuang)于(yu)小EP管(guan)并于(yu)-20℃下(xia)保(bao)存(cun)（24小(xiao)時內檢測可(ke)放入2-8℃儲存(cun)），避免反(fan)復凍融。

※注意：血(xue)清(qing)血(xue)漿樣(yang)本(ben)避免使用溶(rong)血(xue)、高血(xue)脂樣(yang)本(ben)，以免影響檢測結果；如果樣本中的靶標物檢測濃(nong)度高(gao)于標準品的(de)高(gao)值，請將樣品做適(shi)當(dang)倍(bei)數(shu)稀(xi)釋后檢測，建議正式實(shi)驗(yan)前做預(yu)實(shi)驗(yan)以確(que)定稀(xi)釋倍(bei)數(shu)。

試劑準備：

1. 試(shi)劑(ji)回(hui)溫：先在實驗前(qian)30 min將試劑盒(he)，待(dai)測(ce)樣本放置(zhi)于(yu)室溫下，濃縮洗滌液如出(chu)現(xian)結晶，請放入37℃溫浴直(zhi)到結晶全部(bu)溶解。

2. 配制(zhi)洗滌(di)液：預先計算(suan)好稀釋后的洗滌液(ye)使(shi)用體積，然后用雙蒸水或去(qu)離子水將20倍濃縮洗滌(di)液稀(xi)釋成1倍應用液，未用完的濃縮洗滌液放(fang)入4℃冰箱保存。

3. 標準品梯度(du)稀(xi)釋：加入標準(zhun)品(pin)/樣(yang)本(ben)稀釋液(ye)（SR1）1ml凍(dong)干標準(zhun)品中，靜置15分鐘待其(qi)*溶解(jie)后輕輕混勻(yun)(濃(nong)度為1000pg/ml)，用移(yi)液器吸出溶解好的標準(zhun)品(pin)原液250ul,加入750ul標準品/樣本稀釋液（SR1）(濃度為250pg/ml)，然后(hou)按照以(yi)下濃度(du)：250、125、62.5、31.25、15.625、7.8、3.9、 0 pg/ml進(jin)行稀釋。復溶過的(de)標準品原液（1000pg/ml）未用完的應(ying)廢棄或根(gen)據需要按(an)照一次用量(liang)分裝，并(bing)將其貯存在-20～-80℃冰箱，具體如下圖。

4. 生物素化(hua)抗體(ti)工作(zuo)液：預先計算好試驗所需用量，用檢測稀(xi)釋液(ye)（SR2）將100倍抗體(ti)濃縮(suo)液稀釋成(cheng)1倍應用工作液(ye)（稀釋前充分混勻(yun)），請在30分鐘內加入到(dao)反(fan)應孔中。

生物素化抗體工作液具體稀釋方法如下：

5. 酶結合(he)物工(gong)作液：按每次試驗所(suo)需用量配制，用酶結合(he)物稀釋液（SR3）將100倍濃(nong)縮酶結合物稀釋成1倍應用工作液（稀釋前(qian)離心），請在30分(fen)鐘內使用(yong)。

酶結合物工作液具體稀釋方法如下：

6. 洗滌方法：

l 自(zi)動洗(xi)板：甩盡酶標板孔中(zhong)液(ye)體，在(zai)厚迭吸水(shui)紙上拍(pai)干(gan)，注入洗(xi)滌液(ye)為(wei)300ul/孔,注與吸出間隔(ge)為30秒，洗(xi)板5次。

l 手工洗(xi)板(ban)：甩盡酶標板(ban)孔中液(ye)體，在(zai)厚迭吸水紙上拍(pai)干(gan)，用洗(xi)瓶加(jia)入洗(xi)滌液(ye)300ul/孔(kong)，靜止(zhi)30秒后甩凈酶標板孔(kong)中液體，在(zai)厚迭的吸(xi)水紙上拍干，洗板5次。

結果判斷：

1.用酶標儀 450 nm 波長(chang)測(ce)(ce)定 OD 值。選擇雙(shuang)(shuang)波長(chang)檢測(ce)(ce)，參考波長(chang)為 630 nm。如不(bu)能進行(xing)雙(shuang)(shuang)波長(chang)檢測(ce)(ce)，請用 450 nm 的(de)OD測定值(zhi)減去630 nm的OD測定值。

2.計算標準(zhun)(zhun)品(pin)、樣品(pin)的(de)平均OD值(zhi)(zhi)：每個標準(zhun)(zhun)品(pin)和標本的(de)OD值(zhi)(zhi)應減(jian)去零孔的(de)OD值(zhi)(zhi)

3.以標(biao)準品濃度(du)為橫坐標(biao)，吸(xi)光(guang)度(du)OD值為縱(zong)坐標(biao)，用(yong)軟件(jian)繪制標(biao)準曲線，樣品中(zhong)IL-6含量可通(tong)過對應OD值由(you)標準曲線換(huan)算出相(xiang)應的濃度。

4.若標本(ben)OD值高(gao)于標準曲線上限，應做適當稀釋后重新檢測，計(ji)算濃度時(shi)再(zai)乘以稀(xi)釋(shi)倍(bei)數。

參數表征：

1. 數據及標準曲線

本圖(tu)僅(jin)供(gong)參考，應以當(dang)次試(shi)驗標(biao)準(zhun)品(pin)繪(hui)制的標(biao)準(zhun)曲線計算小鼠(shu)IL-6的樣本含量

2. 靈敏度：

低可檢測小鼠IL-6濃(nong)度達2pg/ml，

20個零標準(zhun)品濃度OD的平(ping)均值加上兩(liang)個標準(zhun)差(cha)，計算相應的可檢(jian)測濃度。

3. 特異性：

不(bu)與(yu)小鼠(shu)CT-1、 gp130、 IL-11、 LIF反應，人的IL-6、IL-6 sR 等反應

4. 重復性：

板(ban)內，板(ban)間變(bian)異系(xi)數<10%

5. 回收率：

在(zai)選取的健康小鼠血漿(jiang)、細(xi)胞培養上清中加入 3 個不同濃度水(shui)平的小鼠 IL-6，計算回收率。

6. 線性稀釋：

分(fen)別在選(xuan)取的4 份健(jian)康(kang)小(xiao)鼠血漿和(he)細胞培養上清中加入高濃度小鼠(shu) IL-6，在標準曲線動力(li)學范圍內進行(xing)稀釋，評估線性。