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Mouse IL-1β ELISA KIT

目       錄

背景介紹………………………………………………………………………………

檢測(ce)原理………………………………………………………………………………

注意(yi)事項………………………………………………………………………………

安(an)全提示………………………………………………………………………………

試劑盒組成及儲存……………………………………………………………………

自備實(shi)驗器材…………………………………………………………………………

樣品收集及儲(chu)存………………………………………………………………………

試劑準備………………………………………………………………………………

檢測步驟………………………………………………………………………………

結果判斷………………………………………………………………………………

參數表(biao)征………………………………………………………………………………

參考文獻(xian)………………………………………………………………………………

常見問(wen)題分(fen)析及解決辦法(fa)……………………………………………………………

Mouse IL-1β ELISA KIT背景介紹：

    IL-1分(fen)為IL-1a, IL-1β兩種(zhong),IL-1在(zai)不(bu)(bu)同(tong)(tong)種(zhong)屬中(zhong)有較高同(tong)(tong)源(yuan)(yuan)性(xing)。在(zai)氨基酸水平(ping)上，IL-1α和(he)(he)IL-1β在(zai)不(bu)(bu)同(tong)(tong)種(zhong)屬同(tong)(tong)源(yuan)(yuan)性(xing)分(fen)別為60％～70％和(he)(he)75％～78％；但在(zai)同(tong)(tong)一種(zhong)屬中(zhong)IL-1α與IL-1β同(tong)(tong)源(yuan)(yuan)性(xing)只有25％。IL-1β主要(yao)由血液中(zhong)的單核細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)和(he)(he)巨噬(shi)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)產生 (18), 星形細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，少(shao)突(tu)神(shen)經膠質(zhi)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，腎(shen)上腺皮(pi)質(zhi)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，NK細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，內(nei)皮(pi)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，角質(zhi)形成(cheng)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，巨核細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，血小板，神(shen)經元，中(zhong)性(xing)粒細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，成(cheng)骨細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，許旺細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，滋養(yang)層細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，T細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)和(he)(he)成(cheng)纖維細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)也可(ke)產生IL-1β。IL-1具有廣泛(fan)的免疫(yi)調節作(zuo)用，并有致(zhi)熱和(he)(he)介(jie)導炎癥的作(zuo)用。

 Mouse IL-1β ELISA KIT

檢測原理：

    Solarbio (Solarbio ®)ELISA試(shi)劑盒采用(yong)基于雙(shuang)抗體夾心法的(de)酶聯免疫吸附(fu)檢測技術。將抗小鼠IL-1β單克隆抗體(ti)包被在(zai)酶標板上；分別加入(ru)梯(ti)度(du)稀(xi)釋的標準(zhun)品(pin)和(he)預(yu)稀(xi)釋的樣(yang)(yang)本，標準(zhun)品(pin)和(he)樣(yang)(yang)本中的小(xiao)鼠(shu)IL-1β會與酶標板上的包被抗體充分(fen)結合；洗板后加入生物素化抗小鼠IL-1β抗(kang)體，該(gai)抗(kang)體會與板子(zi)上包被抗(kang)體捕獲的標準品和樣本中的小(xiao)鼠IL-1β發(fa)生(sheng)(sheng)特(te)異性(xing)結合；洗(xi)板(ban)(ban)后加(jia)入辣根過氧化物(wu)酶（HRP）標記的(de)鏈霉親(qin)和素(su)，生(sheng)(sheng)物(wu)素(su)與鏈霉親(qin)和素(su)會(hui)發(fa)生(sheng)(sheng)高強度的(de)非(fei)共(gong)價結合；洗(xi)板(ban)(ban)后加(jia)入顯色(se)劑底物(wu)TMB，若反應孔(kong)中樣品存在不同濃度的(de)小(xiao)鼠IL-1β，則HRP會(hui)使無色TMB變(bian)成不(bu)同深淺(qian)（正相關）的藍(lan)色物(wu)質，加入終止(zhi)液后反(fan)應孔會(hui)變(bian)成黃(huang)色；后，在(zai)λmax=450 nm（OD=450 nm）處(chu)測定反(fan)應孔樣品(pin)吸光(guang)度(du)（OD），樣本中(zhong)的小鼠IL-1β濃度與OD成正比，通過繪制(zhi)標(biao)準(zhun)曲線和四參數擬合軟件(jian)便可計算(suan)出樣本(ben)中小鼠IL-1β的濃度。

原理圖：

注意事項：※※※

1. 試(shi)劑(ji)盒應在有效(xiao)期內使用，請(qing)不要使用過期的試(shi)劑(ji)。

2. 試(shi)劑盒未使用時應保存在2-8℃冰箱，已復溶(rong)但(dan)未用完的標準品，請丟棄。

3. 試劑(ji)盒使用前請在室溫恢(hui)復30 min，且(qie)充(chong)分(fen)混(hun)勻試劑盒(he)里的各(ge)種成份及(ji)制備(bei)的(de)樣(yang)品。

4. 在試(shi)驗(yan)中標(biao)準(zhun)品和樣(yang)本建議作復孔(kong)檢測，且加入試(shi)劑的順(shun)序應保持*。

5. 為避免交叉污染，請在試驗中使用1次性試管，槍頭，封板膜（※）及潔凈塑料容器。.

6. 濃縮(suo)生物(wu)(wu)素(su)化抗體和濃縮(suo)酶(mei)結合物(wu)(wu)的體積較少(shao)，在運輸過程中微量(liang)液(ye)體會沾到管(guan)壁及瓶 

蓋上，使(shi)用前請(qing)離心(xin)處理（5-10 S即(ji)可(ke)），使(shi)管壁上的液體(ti)集中在管底部，取用時，請(qing)用移液器小(xiao)心(xin)吹打幾次。

7. 除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外，請不要使用其他來源試劑盒內含的          

試劑代替本試劑盒中的某單個組分。

8. 為保證結果(guo)準確，每次檢測均需做標準(zhun)曲線。

安全提示：試劑盒中的終止液(ye)為(wei)酸性溶液(ye)，操作人員(yuan)在使用時請帶上手套(tao)并注(zhu)意防(fang)護；在操作過程中也要避免試劑接觸皮膚和眼睛，如果不慎(shen)接觸，請用大量清水清洗；檢測(ce)血(xue)液(ye)樣本(ben)(ben)及其它(ta)體(ti)液(ye)樣本(ben)(ben)時，請按國(guo)家生物實驗室安全防護有關管理規定(ding)執行。

試劑盒組成及儲存：

自備實驗器材（不提供，可代購）

1． 酶標儀(yi)（主波長450nm，參考波長630nm）

2． 高精度移液(ye)器(qi)及(ji)一(yi)次性吸(xi)頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl

3． 洗板(ban)機或洗瓶

4． 37℃孵育箱

5． 雙(shuang)蒸水(shui)，去離(li)子水(shui)，量筒(tong)等(deng)

6． 稀(xi)釋(shi)用(yong)聚丙烯試管

 樣本收集及儲存：

1. 細胞培(pei)養上清：

將細胞培養基移無菌離心(xin)管，在(zai)4℃條件下1000×g離心10 min,然后將(jiang)上清等量分裝于小EP管并(bing)于-20℃下保存（24小時內檢(jian)測可放入(ru)2-8℃儲存），避免反復凍融。

2. 血清樣本：

室(shi)溫血液自(zi)然凝固20 min后，在4℃條件下1000×g離心(xin)10 min，然后將上清等量分裝于(yu)小EP管并(bing)于(yu)-20℃下(xia)保(bao)存（24小時內檢(jian)測可(ke)放入2-8℃儲(chu)存），保(bao)存過程中如有沉(chen)淀，請再次(ci)離心，避免反復凍(dong)融(rong)。

3. 血漿樣本：

將全血收集(ji)到含抗血凝(ning)劑的(de)管中(zhong)，根(gen)據標本的(de)實際要求選(xuan)擇EDTA，檸檬酸鈉(na)或肝(gan)素作為抗凝(ning)劑，混(hun)合20 min，在4℃條件(jian)下(xia)1000×g離心10 min，然后將上清等量分裝于(yu)小(xiao)EP管并于(yu)-20℃下保存（24小時內檢測(ce)可放入2-8℃儲存），避免反復凍融。

※注意：血清(qing)血漿(jiang)樣本避免(mian)使用(yong)溶血、高血脂(zhi)樣本，以免(mian)影響檢測結果；如果樣本中的靶標(biao)物檢(jian)測濃度高于標(biao)準品(pin)的(de)高值，請將樣品(pin)做適(shi)當倍數稀(xi)釋后檢(jian)測，建議正式實驗前做預實驗以確定稀釋倍數。

試劑準備：

1. 試劑(ji)回溫：先在(zai)實驗(yan)前(qian)30 min將試劑盒，待測樣本放置于室(shi)溫(wen)下(xia)，濃(nong)縮洗滌液如出現結晶，請放入37℃溫浴(yu)直到結晶全(quan)部溶解。

2. 配(pei)制洗滌液：預先計算好稀釋后的洗滌液使用體(ti)積，然后用雙蒸水或去離子水將20倍濃縮洗滌液稀釋成1倍應(ying)用液，未用完的濃縮洗滌液放入4℃冰箱保存。

3. 標準品(pin)梯(ti)度稀釋：加入標準品/樣本(ben)稀(xi)釋(shi)液（SR1）1ml凍干(gan)標準(zhun)品中(zhong)，靜置15分(fen)鐘待其*溶解后輕輕混勻(濃度(du)為2000pg/ml)，然(ran)后按照以(yi)下濃度：2000、1000、 500、 250、125、62.5、31.25、 0 pg/ml進(jin)行(xing)稀(xi)釋。復(fu)溶過的標準品原液（2000pg/ml）未(wei)用完的應(ying)廢(fei)棄(qi)或根據需要按照一次用量(liang)分(fen)裝，并(bing)將(jiang)其貯存在-20～-80℃冰箱，具體(ti)如下圖。

4. 生物(wu)素化(hua)抗體工作液(ye)：預先(xian)計算好試驗所需用量，用生物(wu)素化抗體(ti)稀(xi)釋液（SR2）將(jiang)100倍抗體濃縮液稀釋成1倍應(ying)用工作液(ye)（稀(xi)釋(shi)前充分(fen)混勻），請在30分鐘內加入到(dao)反應孔中。

生物素化抗體工作液具體稀釋方法如下：

5. 酶結合物(wu)工(gong)作(zuo)液：按每(mei)次試驗所需用量配制，用酶結合物(wu)稀釋液（SR3）將(jiang)100倍濃縮酶結(jie)合物稀釋成1倍(bei)應用工作液(ye)（稀釋前離心），請(qing)在30分鐘內(nei)使用。

酶結合物工作液具體稀釋方法如下：

6. 洗滌方法(fa)：

l 自動洗板(ban)(ban)：甩(shuai)盡酶(mei)標板(ban)(ban)孔中液體(ti)，在厚迭吸水(shui)紙上拍干，注入洗滌液為300ul/孔,注與吸出間(jian)隔為30秒，洗板5次(ci)。

l 手工洗(xi)(xi)板：甩盡酶標板孔中液(ye)(ye)體，在厚迭吸水紙上(shang)拍(pai)干，用(yong)洗(xi)(xi)瓶加入洗(xi)(xi)滌液(ye)(ye)300ul/孔(kong)，靜止30秒后(hou)甩(shuai)凈(jing)酶(mei)標板(ban)孔(kong)中液體，在厚迭的吸水紙上拍(pai)干，洗板(ban)5次。

結果判斷：

1.用酶標(biao)儀 450 nm 波長(chang)測定 OD 值。選擇雙(shuang)波長(chang)檢測，參考波長(chang)為(wei) 630 nm。如(ru)不(bu)能進行雙(shuang)波長(chang)檢測，請用 450 nm 的OD測定值減去630 nm的OD測定值。

2.計算標準品、樣(yang)品的平均OD值：每個(ge)標準品和(he)標本的OD值應減去(qu)零孔的OD值

3.以標(biao)(biao)準品(pin)濃度(du)為橫坐標(biao)(biao)，吸光(guang)度(du)OD值為縱坐標(biao)(biao)，用軟件繪(hui)制標(biao)(biao)準曲線，樣品(pin)中(zhong)IL-1β含量可通過對(dui)應(ying)OD值由標準曲線(xian)換算出(chu)相(xiang)應(ying)的濃度。

4.若標(biao)本OD值高于(yu)標(biao)準曲線(xian)上(shang)限，應做適當稀釋后(hou)重(zhong)新檢測(ce)，計(ji)算濃度時再乘(cheng)以稀釋倍數。

參數表征：

1. 數據及標準曲線

本圖僅供參考，應以當次試驗標準品(pin)繪(hui)制的標準曲(qu)線計算小鼠IL-1β的(de)樣本含量

2. 靈敏度：

低可(ke)檢測小(xiao)鼠IL-1β濃度(du)達15pg/ml，

20個零標(biao)準品(pin)濃度OD的平(ping)均值加上兩(liang)個標(biao)準差，計算相(xiang)應的可檢測濃度。

3. 特異性：

不與小(xiao)鼠IL-1ra 、IL-1α、IL-1 RI、IL-1 RII等反應，豬的IL-1β等反應

4. 重復性：

板(ban)內，板(ban)間(jian)變異系數<10%

5. 回收率：

在選(xuan)取的(de)健康(kang)小鼠血(xue)漿、細胞培養(yang)上(shang)清中加入 3 個不(bu)同(tong)濃度水平(ping)的(de)小鼠IL-1β，計算回(hui)收率。

6. 線性稀釋：

分別在選(xuan)取的(de)4 份健康(kang)小鼠血漿和細胞培養(yang)上清中加(jia)入高濃度小鼠 IL-1β，在標(biao)準曲(qu)線動力學范圍內(nei)進(jin)行稀(xi)釋，評估線性(xing)。

參考文獻：

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