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無噬菌體，低內毒素優等胎牛血清

無噬菌體，低內毒素優等胎牛血清通常作為補充成(cheng)分(fen)(fen)添加(jia)在(zai)基(ji)礎培養(yang)基(ji)內(nei)使(shi)用(yong)。它(ta)(ta)能夠提(ti)供各種大(da)分(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)蛋白，小(xiao)分(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)量營養(yang)，水(shui)溶性成(cheng)分(fen)(fen)的(de)(de)(de)(de)轉(zhuan)運蛋白，和其它(ta)(ta)一些細胞在(zai)體外所必(bi)需的(de)(de)(de)(de)成(cheng)分(fen)(fen)，如激素和附著因(yin)(yin)子(zi)(zi)(zi)。血(xue)清(qing)可以結合(he)或中(zhong)和一些生長因(yin)(yin)子(zi)(zi)(zi)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)有(you)毒成(cheng)分(fen)(fen)，并提(ti)供培養(yang)基(ji)的(de)(de)(de)(de)緩沖(chong)能力(li)。細胞培養(yang)時(shi)血(xue)清(qing)的(de)(de)(de)(de)添加(jia)依賴于基(ji)礎培養(yang)基(ji)的(de)(de)(de)(de)化學組成(cheng)，培養(yang)細胞的(de)(de)(de)(de)類型，及所用(yong)的(de)(de)(de)(de)培養(yang)系統。

我們在(zai)提(ti)供細胞(bao)培(pei)養(yang)基(ji)、平衡鹽溶(rong)液、無血清培(pei)養(yang)基(ji)和試劑(ji)的(de)同時，還提(ti)供高品(pin)質的(de)血清。我們對血清制備進行全過(guo)程(cheng)(cheng)監管。從血清收集到終產品(pin)檢驗和內部稽核的(de)每一個步驟，我們都采用(yong)設備和標準操作程(cheng)(cheng)序，以確(que)保整(zheng)(zheng)個過(guo)程(cheng)(cheng)中每個環節的(de)產品(pin)質量(liang)。對整(zheng)(zheng)個過(guo)程(cheng)(cheng)的(de)控制可以保證產品(pin)的(de)持續高品(pin)質，降低不同批次的(de)差異。

處理(li)：全部(bu)血(xue)(xue)清(qing)：收(shou)集(ji)的(de)血(xue)(xue)液(ye)均(jun)在冷藏條件下處理(li)。血(xue)(xue)清(qing)和血(xue)(xue)塊分(fen)離后立即將血(xue)(xue)清(qing)合并并冷凍。只有(you)符合我們的(de)檢(jian)測標準的(de)血(xue)(xue)清(qing)才被(bei)接受(shou)作進一步處理(li)。

熱滅(mie)(mie)活(huo)(huo)血(xue)(xue)清(qing)(qing)：熱滅(mie)(mie)活(huo)(huo)是在(zai)56℃水浴中(zhong)嚴格控(kong)溫(wen)30分(fen)鐘。透(tou)析血(xue)(xue)清(qing)(qing)：用10,000截留分(fen)子(zi)量(liang)(liang)的(de)(de)透(tou)析膜在(zai)0.15M的(de)(de)NaCl中(zhong)進(jin)(jin)行(xing)透(tou)析，直到(dao)葡萄糖水平低于5mg/dl(用鄰甲苯胺測試法(fa)檢驗)。γ射(she)(she)線照(zhao)射(she)(she)血(xue)(xue)清(qing)(qing)：可按客戶要求對(dui)血(xue)(xue)清(qing)(qing)進(jin)(jin)行(xing)γ射(she)(she)線照(zhao)射(she)(she)。通(tong)過(guo)(guo)(guo)γ射(she)(she)線照(zhao)射(she)(she)以(yi)滅(mie)(mie)活(huo)(huo)各種動物血(xue)(xue)清(qing)(qing)(包(bao)括胎牛血(xue)(xue)清(qing)(qing)、新(xin)生牛血(xue)(xue)清(qing)(qing)、豬血(xue)(xue)清(qing)(qing)和(he)(he)馬血(xue)(xue)清(qing)(qing))中(zhong)的(de)(de)病毒(du)和(he)(he)支原體(ti)的(de)(de)方法(fa)已經得到(dao)證實。研究證實照(zhao)射(she)(she)劑量(liang)(liang)在(zai)30-45kGy為宜。血(xue)(xue)清(qing)(qing)在(zai)此照(zhao)射(she)(she)后(hou)物理化學(xue)特性(xing)和(he)(he)細胞培養表現(xian)沒有變化。裝瓶：粗血(xue)(xue)清(qing)(qing)須通(tong)過(guo)(guo)(guo)一(yi)系列的(de)(de)過(guo)(guo)(guo)濾(lv)(lv)才成為成品。后(hou)的(de)(de)過(guo)(guo)(guo)濾(lv)(lv)步驟(zou)包(bao)括使用0.2um和(he)(he)0.1um的(de)(de)無菌(jun)過(guo)(guo)(guo)濾(lv)(lv)。胎牛血(xue)(xue)清(qing)(qing)須通(tong)過(guo)(guo)(guo)三次0.1um過(guo)(guo)(guo)濾(lv)(lv)，其(qi)他血(xue)(xue)清(qing)(qing)須通(tong)過(guo)(guo)(guo)0.2um過(guo)(guo)(guo)濾(lv)(lv)。終(zhong)產品的(de)(de)質量(liang)(liang)控(kong)制(zhi)：我們采取(qu)以(yi)下(xia)方法(fa)對(dui)每一(yi)批次的(de)(de)產品選(xuan)取(qu)一(yi)定數量(liang)(liang)的(de)(de)樣品進(jin)(jin)行(xing)質量(liang)(liang)控(kong)制(zhi)分(fen)析：

化學檢(jian)測：使用低溫(wen)凝固點的(de)(de)方法檢(jian)測滲透壓(ya)，以保(bao)證符(fu)合(he)產(chan)品規范。我們(men)每(mei)天使用國家標(biao)(biao)準的(de)(de)技術(shu)研(yan)究(jiu)所標(biao)(biao)定(ding)的(de)(de)標(biao)(biao)準溶液(ye)對(dui)我們(men)的(de)(de)滲透壓(ya)檢(jian)測儀器進(jin)行校(xiao)準。同樣每(mei)天使用國家標(biao)(biao)準技術(shu)研(yan)究(jiu)所標(biao)(biao)定(ding)的(de)(de)標(biao)(biao)準溶液(ye)對(dui)pH計進(jin)行校(xiao)準。

使(shi)用(yong)電泳圖譜鑒(jian)定血(xue)清的(de)(de)(de)整體性質。樣品(pin)被轉移到硝酸(suan)纖(xian)維素基(ji)質中(zhong)，并在(zai)緩沖體系內遷移。條(tiao)帶經(jing)染色、清潔(jie)、干燥后用(yong)密度(du)儀進行掃描，以檢(jian)測白蛋(dan)(dan)白和(he)球(qiu)蛋(dan)(dan)白組分的(de)(de)(de)相對(dui)(dui)濃度(du)。為證實是否(fou)在(zai)適當的(de)(de)(de)條(tiao)件下進行采(cai)血(xue)和(he)處理，使(shi)用(yong)修飾的(de)(de)(de)Fleming方(fang)法對(dui)(dui)血(xue)紅(hong)蛋(dan)(dan)白進行分光光度(du)檢(jian)測。

隨著動物(wu)年齡(ling)(ling)的(de)增加，血清總(zong)蛋白(bai)含(han)量也(ye)相應地提高。使(shi)(shi)用自(zi)動化的(de)Biuret方法進行總(zong)血清蛋白(bai)的(de)檢(jian)測(ce)，以確(que)認(ren)動物(wu)年齡(ling)(ling)并驗證符合產(chan)品(pin)規范。使(shi)(shi)用色(se)度(du)計(ji)在不同波長下檢(jian)測(ce)樣品(pin)和Biuret試劑混合波的(de)吸光度(du)。自(zi)動計(ji)算結果后，與標準曲(qu)線比較，即可得到蛋白(bai)值(克/公升)。

穩(wen)(wen)定性檢測程(cheng)序：在每一個標記(ji)為體(ti)外診斷的(de)(de)(de)產(chan)品(pin)上顯示的(de)(de)(de)效(xiao)期(qi)(qi)表明(ming)了這個產(chan)品(pin)具有多長時間的(de)(de)(de)效(xiao)能。我們(men)的(de)(de)(de)穩(wen)(wen)定性程(cheng)序確定和證(zheng)明(ming)了產(chan)品(pin)效(xiao)期(qi)(qi)。我們(men)定期(qi)(qi)監測批量產(chan)品(pin)，確定產(chan)品(pin)在推薦貯存條件下(xia)具有可接受效(xiao)果(guo)的(de)(de)(de)時間長度。

微生(sheng)(sheng)物(wu)學檢(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)：所有血(xue)清使用Barile&Kern的(de)(de)大體(ti)(ti)積方法(fa)檢(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)支原(yuan)體(ti)(ti)。在推薦方法(fa)的(de)(de)檢(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)范圍內(nei)檢(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)結果是準(zhun)確的(de)(de)。樣品少(shao)應該在肉(rou)湯中合并培(pei)養3個星(xing)期(qi)，同時要在瓊脂平板(ban)(ban)(ban)上進(jin)行不少(shao)于(yu)4次(ci)(ci)(ci)傳(chuan)代培(pei)養。在有氧和厭氧(95%氮，5%CO2)條件下，平板(ban)(ban)(ban)在36±2℃下孵育。在檢(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)過程中，每周對(dui)(dui)(dui)瓊脂平板(ban)(ban)(ban)進(jin)行一次(ci)(ci)(ci)微生(sheng)(sheng)物(wu)生(sheng)(sheng)長情況檢(jian)(jian)(jian)(jian)驗。使用Dienes染(ran)色法(fa)對(dui)(dui)(dui)懷(huai)疑被污(wu)染(ran)的(de)(de)瓊脂平板(ban)(ban)(ban)進(jin)行支原(yuan)體(ti)(ti)菌落的(de)(de)檢(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)。然后，對(dui)(dui)(dui)平板(ban)(ban)(ban)進(jin)行再次(ci)(ci)(ci)鏡檢(jian)(jian)(jian)(jian)。對(dui)(dui)(dui)孵育肉(rou)湯瓶要定期(qi)進(jin)行濁(zhuo)度和pH值變動(dong)的(de)(de)檢(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)。在推薦方法(fa)檢(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)范圍內(nei)，所有血(xue)清也(ye)要使用Hoechst熒光(guang)DNA染(ran)色法(fa)進(jin)行不可在肉(rou)湯中培(pei)養的(de)(de)支原(yuan)體(ti)(ti)(包括M.hyorhinis屬)檢(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)。

病毒(du)檢(jian)測(ce)(ce)：已知無(wu)外來物(wu)質(zhi)的(de)(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)培(pei)(pei)養基(ji)須經(jing)過(guo)在(zai)包含15%測(ce)(ce)試血(xue)清的(de)(de)(de)(de)生長(chang)培(pei)(pei)養基(ji)中進行(xing)為期(qi)21天(tian)的(de)(de)(de)(de)三次傳代培(pei)(pei)養。使用對(dui)照(zhao)培(pei)(pei)養基(ji)和已知對(dui)外來物(wu)質(zhi)為陰性的(de)(de)(de)(de)血(xue)清平(ping)行(xing)地維持陰性對(dui)照(zhao)培(pei)(pei)養。整個期(qi)間(jian)，檢(jian)測(ce)(ce)所有的(de)(de)(de)(de)培(pei)(pei)養情(qing)況，以便發(fa)現是(shi)否存(cun)在(zai)病毒(du)誘發(fa)的(de)(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)形態改變或致細(xi)胞(bao)病變效應。在(zai)1421天(tian)的(de)(de)(de)(de)培(pei)(pei)養期(qi)間(jian)，對(dui)含有檢(jian)測(ce)(ce)血(xue)清的(de)(de)(de)(de)平(ping)行(xing)培(pei)(pei)養瓶按下面(mian)標準病毒(du)檢(jian)測(ce)(ce)方(fang)法進行(xing)評估。

將其中一瓶檢(jian)測(ce)細(xi)胞用胰蛋白酶消化(hua)，然(ran)后(hou)把細(xi)胞分別(bie)加入到總(zong)(zong)面積為6cm 2 的六(liu)室載玻片上(shang)。同時準備陰性(xing)對(dui)(dui)照(zhao)載玻片。在檢(jian)測(ce)培養(yang)的單室載玻片上(shang)加入牛(niu)病(bing)毒(du)性(xing)腹瀉病(bing)毒(du)(BVDV)、牛(niu)細(xi)小病(bing)毒(du)、牛(niu)腺病(bing)毒(du)、狂犬病(bing)毒(du)和呼(hu)腸病(bing)毒(du)的染(ran)色(se)劑，作為單個的陽性(xing)對(dui)(dui)照(zhao)。再經過7天(tian)培養(yang)(總(zong)(zong)共21天(tian))，利用熒(ying)光抗(kang)體技術檢(jian)測(ce)病(bing)毒(du)。

通過對檢(jian)測培養進(jin)行蘇(su)木精伊紅染色，觀察致(zhi)細胞突(tu)變效(xiao)應(CPE)或(huo)其他(ta)病(bing)毒誘(you)導效(xiao)應。檢(jian)測細胞是(shi)否存在CPE效(xiao)應、內含物、多(duo)核體(ti)或(huo)其他(ta)異常效(xiao)應。

內毒素檢(jian)測：我們用阿米巴變形細(xi)胞溶解物(LAL)凝膠法來檢(jian)測胎(tai)牛(niu)血清的內毒素含量。

效能檢測：

對每(mei)一批次的胎牛血清(qing)，我們都(dou)進(jin)行下述培養效能(neng)檢測。選擇血清(qing)重(zhong)要的標準是其(qi)支持特(te)殊細胞(bao)的生長(chang)能(neng)力。因此，除了保證血清(qing)通過嚴格的品(pin)質控制，我們也同時在實驗室(shi)條件下對血清(qing)的三個重(zhong)要的培養效能(neng)進(jin)行檢測：克隆效率、貼(tie)壁效果(guo)和二倍體成纖維細胞(bao)生長(chang)促(cu)進(jin)。

克隆效率分析：克隆效率實驗分析每一批胎牛血清促進小鼠骨髓瘤細胞及其衍生的雜交瘤細胞的克隆和生長能力。下列產品
經驗證可用于該實驗：
Sp2/0-Ag14(ATCC #CRL 1581)
P3x63-Ag8.653(ATCC #CRL 1580)

每一(yi)(yi)(yi)批胎牛(niu)血(xue)清(qing)(qing)(qing)都(dou)要分(fen)別在復制微量(liang)(liang)滴定平(ping)板上(shang)加入兩種血(xue)清(qing)(qing)(qing)濃度和兩種細胞接種量(liang)(liang)(10%血(xue)清(qing)(qing)(qing)和1cell/孔，4%血(xue)清(qing)(qing)(qing)和5cells/孔)的(de)(de)(de)情況下(xia)進行分(fen)析。克(ke)隆分(fen)析結果除以(yi)已(yi)確定的(de)(de)(de)參照血(xue)清(qing)(qing)(qing)值(zhi)得以(yi)歸一(yi)(yi)(yi)化。在許(xu)多日常雜(za)交(jiao)選擇程(cheng)序中具(ju)有代(dai)表性(xing)的(de)(de)(de)是高濃度的(de)(de)(de)血(xue)清(qing)(qing)(qing)，而低濃度血(xue)清(qing)(qing)(qing)在設計(ji)血(xue)清(qing)(qing)(qing)批次細微差異放大檢測(ce)中有更為(wei)(wei)嚴格的(de)(de)(de)測(ce)試(shi)。嚴格的(de)(de)(de)1cell/孔測(ce)試(shi)是模(mo)擬單一(yi)(yi)(yi)雜(za)交(jiao)選擇的(de)(de)(de)實(shi)驗室條(tiao)(tiao)件(jian)(jian)。為(wei)(wei)每一(yi)(yi)(yi)批次胎牛(niu)血(xue)清(qing)(qing)(qing)提(ti)供的(de)(de)(de)分(fen)析證(zheng)明報告(gao)中的(de)(de)(de)克(ke)隆效(xiao)率值(zhi)為(wei)(wei)兩次測(ce)試(shi)條(tiao)(tiao)件(jian)(jian)下(xia)的(de)(de)(de)平(ping)均值(zhi)。

克隆分析法：克隆分析法是在復式96孔板中加入兩種胎牛血清濃度(10%v/v)和(4%v/v)和兩種接種量的情況下進行的。每一次化驗中，同時測量前期已驗證合格的一批胎牛血清，并將此測量值作為內部參考標準。
克隆(long)分(fen)析按下(xia)述方法(fa)進行(xing)：

1．Sp2/0-Ag14(sp2)和P3x63-Ag8.653(653)在含(han)有10%的胎牛血清(qing)的RPM1640中通(tong)常保持對數(shu)生長(chang)期(qi)。在顯微鏡下，利用(yong)臺盼藍排除法(fa)對活細胞進(jin)行計數(shu)。

2．用RPM1640培(pei)養(yang)基(ji)將儲(chu)備細胞(bao)懸浮液進行連續稀釋，使其達(da)到預期的(de)25cells/ml和5cells/ml接(jie)種(zhong)濃度。準備含有(you)參(can)照(zhao)或測試胎牛血清的(de)RPM1640培(pei)養(yang)基(ji)。將這種(zhong)密(mi)度的(de)細胞(bao)分配(pei)到各個分析生(sheng)長培(pei)養(yang)基(ji)體(ti)積(ji)為0.2毫升(sheng)的(de)孔中，使其分別平均(jun)含有(you)5個和1個細胞(bao)。

3．將96孔(kong)板(ban)放(fang)入36±2℃，4-6% CO 2 的潮(chao)濕(shi)培(pei)養箱孵育約1015天。

4．在孵(fu)(fu)育(yu)期間，用肉(rou)眼觀察平(ping)板并對用于克隆的孔(kong)進(jin)行計(ji)數(shu)。克隆效率(lv)按下列方法(fa)計(ji)算：克隆效率(lv)=(陽(yang)性孔(kong)平(ping)均數(shu)/孵(fu)(fu)育(yu)孔(kong)總數(shu))×100%

5．每一批次胎牛血(xue)清維持(chi)指(zhi)示劑骨髓瘤細(xi)(xi)胞克(ke)隆效(xiao)(xiao)率(lv)(lv)的定量(liang)按(an)照以(yi)下方法測(ce)(ce)得(de)的相對(dui)克(ke)隆效(xiao)(xiao)率(lv)(lv)(RCE)進行(xing)歸一化：RCE=檢測(ce)(ce)血(xue)清的克(ke)隆效(xiao)(xiao)率(lv)(lv)/對(dui)照血(xue)清的克(ke)隆效(xiao)(xiao)率(lv)(lv)貼(tie)壁效(xiao)(xiao)率(lv)(lv)分(fen)析：貼(tie)壁效(xiao)(xiao)率(lv)(lv)分(fen)析是利用(yong)已轉(zhuan)型(xing)的人類細(xi)(xi)胞系來檢測(ce)(ce)每一批血(xue)清促使持(chi)續貼(tie)附(fu)細(xi)(xi)胞系的生長能(neng)(neng)力。選擇已被驗證(zheng)可(ke)以(yi)檢測(ce)(ce)貼(tie)壁效(xiao)(xiao)率(lv)(lv)的細(xi)(xi)胞系A549(人肺(fei)腫瘤細(xi)(xi)胞，ATCC#CCL,185)，是因為它可(ke)以(yi)區分(fen)一批血(xue)清維持(chi)細(xi)(xi)胞貼(tie)壁和繁殖能(neng)(neng)力的細(xi)(xi)微差異(yi)。

每一(yi)批次胎(tai)牛(niu)血(xue)(xue)(xue)清(qing)都要在兩種血(xue)(xue)(xue)清(qing)濃度(du)和兩種細胞接種濃度(du)下(10%血(xue)(xue)(xue)清(qing)和100cells/孔，4%血(xue)(xue)(xue)清(qing)和200cells/孔)測(ce)(ce)試(shi)三次。在36±2℃，4-6% CO 2 的(de)(de)(de)潮濕(shi)培養(yang)箱(xiang)孵育約1014天，對被染色的(de)(de)(de)細胞菌落進行計數即可得(de)到(dao)其貼(tie)壁效率。將結果除以參考的(de)(de)(de)對照血(xue)(xue)(xue)清(qing)得(de)以歸(gui)一(yi)化。通過(guo)兩種血(xue)(xue)(xue)清(qing)濃度(du)的(de)(de)(de)測(ce)(ce)試(shi)，可以驗證該批次血(xue)(xue)(xue)清(qing)在減量(liang)和標準水平下維持生長的(de)(de)(de)能力。為每一(yi)批次胎(tai)牛(niu)血(xue)(xue)(xue)清(qing)提(ti)供的(de)(de)(de)分析證明報告中的(de)(de)(de)貼(tie)壁效率值為兩次測(ce)(ce)試(shi)條件下的(de)(de)(de)平均值。

貼(tie)壁分(fen)析(xi)法(fa)：使(shi)用(yong)貼(tie)附分(fen)析(xi)檢測上述(shu)每一(yi)批測試(shi)血(xue)清。這種分(fen)析(xi)法(fa)針對每一(yi)個(ge)血(xue)清樣品使(shi)用(yong)一(yi)個(ge)6孔板(每室9.6cm 2 )，并(bing)(bing)可以對三個(ge)孔的數據進(jin)行平(ping)均處(chu)理。每一(yi)次(ci)化(hua)驗(yan)中，同時測量前期已驗(yan)證(zheng)合格的一(yi)批胎(tai)牛(niu)血(xue)清，并(bing)(bing)將此(ci)測量值作為內部參考(kao)標準。

貼附(fu)分析(xi)按下述方(fang)法進行(xing)：

1．A549細胞系(xi)用含(han)有10%胎牛血(xue)清的DMEM培養基(ji)，在36±2℃，以亞融合密度下進(jin)行培養。

2．含(han)10%(v/v)和4%(v/v)血(xue)(xue)清(qing)的DMEM由分別在22.5毫升(sheng)和24毫升(sheng)DMEM中加入2.5毫升(sheng)和1毫升(sheng)胎(tai)牛血(xue)(xue)清(qing)配(pei)制而成，終有效體積(ji)為25毫升(sheng)。將5毫升(sheng)含(han)血(xue)(xue)清(qing)培養(yang)基分別加入6孔(kong)板的每一個孔(kong)中。

3．A549培養細胞(bao)先經過胰蛋白(bai)酶(mei)消化，測定活細胞(bao)數，然(ran)后稀釋細胞(bao)懸浮液2,000cells/ml。

4．將0.1毫(hao)(hao)升(sheng)細(xi)胞懸浮(fu)液(ye)加入200cells/孔室中(zhong)，0.05毫(hao)(hao)升(sheng)懸浮(fu)液(ye)加入100cells/孔室中(zhong)。平板(ban)混合(he)后放入36±2℃，5%CO 2 的潮濕培養箱(xiang)孵育約1014天。

5．孵(fu)育后，取(qu)出平板(ban)，去(qu)除生長培養(yang)基，用亞(ya)甲基蘭-甲醇溶液(ye)對菌落進行染色。

6．計算菌落形成，然后按下述方法(fa)計算貼壁(bi)效(xiao)率(lv)(lv)：%貼壁(bi)效(xiao)率(lv)(lv)=每孔菌落平均數/每孔孵育活細胞平均數×100

7．為(wei)方便比較，將測得的(de)貼(tie)壁(bi)效率(lv)數值(zhi)除(chu)以每批檢測血(xue)(xue)清(qing)(qing)的(de)相對貼(tie)壁(bi)效率(lv)(RPE)得以歸一(yi)化：RCE=檢測血(xue)(xue)清(qing)(qing)的(de)貼(tie)壁(bi)效率(lv)/參照(zhao)血(xue)(xue)清(qing)(qing)的(de)貼(tie)壁(bi)效率(lv)二(er)倍體成纖維(wei)(wei)細胞(bao)生長(chang)：促進(jin)生長(chang)分析用于檢測每一(yi)批胎牛血(xue)(xue)清(qing)(qing)維(wei)(wei)持難培養(yang)的(de)人(ren)二(er)倍體成纖維(wei)(wei)細胞(bao)長(chang)期生長(chang)的(de)能(neng)力。

下列細胞系經(jing)認(ren)證可用于該實驗(yan)：

WI-38(人二倍體肺成纖維細(xi)胞，ATCC#CCL 75)

WI-38細(xi)胞在含5%胎牛(niu)血(xue)清(qing)的(de)(de)(de)低(di)密度(2X10 5 /瓶(ping))復式(shi)25-cm 2瓶(ping)中(zhong)孵育，并(bing)進(jin)(jin)行為期三個(ge)(ge)連(lian)續(xu)7天的(de)(de)(de)傳代(dai)(dai)培(pei)(pei)養(yang)。在每(mei)一個(ge)(ge)培(pei)(pei)養(yang)期，細(xi)胞都從初始(shi)孵育密度開始(shi)傳代(dai)(dai)培(pei)(pei)養(yang)。壓力(li)分層率、成(cheng)倍繁殖數(shu)量和減量血(xue)清(qing)濃度是每(mei)批(pi)次(ci)(ci)促進(jin)(jin)難(nan)培(pei)(pei)養(yang)二倍體細(xi)胞的(de)(de)(de)生(sheng)(sheng)(sheng)長(chang)血(xue)清(qing)的(de)(de)(de)嚴格測(ce)試指(zhi)標。通過連(lian)續(xu)三代(dai)(dai)培(pei)(pei)養(yang)以減少前一次(ci)(ci)生(sheng)(sheng)(sheng)長(chang)培(pei)(pei)養(yang)基的(de)(de)(de)殘留影響(xiang)，從而保證得(de)到檢測(ce)批(pi)促進(jin)(jin)生(sheng)(sheng)(sheng)長(chang)能力(li)的(de)(de)(de)真實結果。為每(mei)一批(pi)次(ci)(ci)胎牛(niu)血(xue)清(qing)提(ti)供的(de)(de)(de)分析證明報(bao)告為第三次(ci)(ci)傳代(dai)(dai)培(pei)(pei)養(yang)每(mei)復式(shi)培(pei)(pei)養(yang)瓶(ping)細(xi)胞數(shu)的(de)(de)(de)平(ping)均值(zhi)。將檢測(ce)值(zhi)除以參(can)考對(dui)照值(zhi)得(de)以歸一化。

二(er)倍體成(cheng)纖維細(xi)(xi)胞(bao)生(sheng)長(chang)(chang)分析法：培養數(shu)代WI-38人類二(er)倍體肺(fei)成(cheng)纖維細(xi)(xi)胞(bao)，計算每一代的(de)細(xi)(xi)胞(bao)總數(shu)。此項檢測所挑選出的(de)胎牛(niu)血(xue)清批號能維持難以生(sheng)長(chang)(chang)細(xi)(xi)胞(bao)、貼壁(bi)性細(xi)(xi)胞(bao)、正常(chang)的(de)細(xi)(xi)胞(bao)株(zhu)生(sheng)長(chang)(chang)及存活。

1．準備含(han)(han)5%檢(jian)測血清(qing)或已驗證合(he)格(ge)的參照血清(qing)生(sheng)長(chang)培養(yang)(yang)基(ji)，基(ji)礎生(sheng)長(chang)培養(yang)(yang)基(ji)為含(han)(han)L-谷氨酰(xian)胺(an)的HBME：EBME(1：1)。按要(yao)求，在每一次流量變化(hua)和(he)分析過(guo)程中進行傳代培養(yang)(yang)時(shi)需配制含(han)(han)5%血清(qing)生(sheng)長(chang)的培養(yang)(yang)基(ji)。

2．在低代(dai)培(pei)養(yang)水平(ping)時(shi)，將(jiang)2X10 5 WI-38細胞加入(ru)(ru)各個含9.5毫升生長培(pei)養(yang)基(ji)(ji)的復式25-cm 2 培(pei)養(yang)基(ji)(ji)中(zhong)(zhong)。在不擰(ning)緊(jin)瓶(ping)蓋的情況下，將(jiang)培(pei)養(yang)瓶(ping)放(fang)入(ru)(ru)4-6%CO 2， 36℃±2℃環境(jing)中(zhong)(zhong)，保持24小時(shi)。然后擰(ning)緊(jin)瓶(ping)蓋，將(jiang)培(pei)養(yang)瓶(ping)放(fang)在36℃±2℃下孵育7天(tian)，在第(di)2天(tian)或(huo)第(di)3天(tian)全部更(geng)換培(pei)養(yang)基(ji)(ji)。

3．在第7天，用(yong)胰蛋白酶對每一個(ge)含(han)參(can)照或檢(jian)測血清的(de)復(fu)式(shi)瓶(ping)中的(de)細(xi)胞(bao)進行(xing)消化得到一定數量細(xi)胞(bao)，然后(hou)合并(bing)并(bing)計數。將2x10 5 WI-38細(xi)胞(bao)加(jia)入含(han)有新鮮生長培養(yang)基(已加(jia)入了(le)與上一代同(tong)一批(pi)次的(de)參(can)照或檢(jian)測胎牛血清)的(de)新的(de)復(fu)式(shi)25-cm 2 瓶(ping)中，進行(xing)細(xi)胞(bao)傳(chuan)代培養(yang)。按(an)第2步所述，將培養(yang)瓶(ping)進行(xing)平衡并(bing)孵育。

4．如上所述(shu)經過三代(dai)連續分析，在每一代(dai)結束時(shi)計算(suan)每一批參照或檢(jian)(jian)測(ce)血(xue)清的(de)每瓶細胞平均(jun)數。后一代(dai)培(pei)養的(de)各批檢(jian)(jian)測(ce)血(xue)清實(shi)驗中(zhong)的(de)相對生長率(lv)(RGR)作為參照血(xue)清實(shi)驗中(zhong)獲得的(de)細胞生長率(lv)分子：

%RGR=檢測(ce)(ce)血(xue)(xue)清(qing)(qing)實驗(yan)中(zhong)(zhong)每瓶平均細胞(bao)數(shu)/參照血(xue)(xue)清(qing)(qing)實驗(yan)中(zhong)(zhong)每瓶平均細胞(bao)數(shu)X100S f9細胞(bao)生長促進分(fen)(fen)析。通過昆蟲分(fen)(fen)析可以(yi)保證您(nin)購(gou)買的(de)(de)胎牛血(xue)(xue)清(qing)(qing)批次可以(yi)維(wei)持S f9細胞(bao)的(de)(de)生長。收(shou)到(dao)產品(pin)后，您(nin)需(xu)要做(zuo)的(de)(de)就是混勻血(xue)(xue)清(qing)(qing)，在(zai)56℃下熱(re)滅活(huo)30分(fen)(fen)鐘。這(zhe)種分(fen)(fen)析法也可以(yi)用(yong)于(yu)(yu)乳(ru)白蛋白水解(jie)產品(pin)、酵母和其它生長輔料作為原料的(de)(de)生物效能分(fen)(fen)析。該分(fen)(fen)析法的(de)(de)準(zhun)確性(xing)取(qu)決于(yu)(yu)是否用(yong)常規的(de)(de)細胞(bao)培(pei)養(yang)方案進行(xing)培(pei)養(yang)。用(yong)臺盼(pan)藍染色排(pai)除法測(ce)(ce)得的(de)(de)細胞(bao)活(huo)性(xing)少不低于(yu)(yu)80%。

細胞生長分析法。

1．使用含10%檢測或(huo)參照熱滅活胎牛(niu)血(xue)清(qing)的已驗證的Grace昆(kun)明培養基(ji)配制(zhi)*檢測培養基(ji)。

2．將儲備Sf9細胞加入50毫(hao)升離心管(guan)中，在50Xg下離心5分鐘(zhong)。然后將每支(zhi)試管(guan)的沉淀物重新用含10%的檢(jian)測(ce)或參照(zhao)熱滅(mie)活胎牛血清*培(pei)養基配(pei)制(zhi)成懸浮(fu)液(ye)。

3．反試管(guan)顛倒(dao)幾次(ci)，然后每(mei)支試管(guan)倒(dao)出1毫(hao)升樣(yang)品。用臺盼(pan)藍染(ran)色排除(chu)進行活細胞計數。

4．如果活(huo)性≥80%，把試(shi)管再(zai)顛倒幾次并取出0.25毫(hao)升樣品(pin)。然(ran)后用Coulter計數(shu)器(qi)進(jin)行細胞(bao)計數(shu)。

5．將細(xi)胞(bao)(bao)加(jia)入Erlenmeyer瓶(ping)中，使(shi)其終細(xi)胞(bao)(bao)濃度為2.75X10 5 cells/ml。孵育(yu)后(hou)，再一次進行細(xi)胞(bao)(bao)計數(shu)，以(yi)保證(zheng)細(xi)胞(bao)(bao)密(mi)度為2.5X10 5 3.0X10 5 cells/ml。

6．將培養瓶(ping)放到搖床上，在27℃±;1℃、80-90rpm條件(jian)下孵育96小(xiao)時。

7．從每(mei)一(yi)培養瓶中分(fen)別取出(chu)0.25毫升樣品，用Coulter計數器進(jin)行計數。同(tong)時取出(chu)一(yi)定量的樣品進(jin)行細胞活性檢測。

8．將(jiang)檢測(ce)細(xi)胞密度與參照(zhao)細(xi)胞密度相比即可得到相對細(xi)胞密度(RCN)。

噬菌(jun)體檢測:我們利(li)用溶(rong)菌(jun)斑分(fen)(fen)析法來檢測是(shi)否存在噬菌(jun)體。從(cong)每一(yi)批血清中取具代表性的(de)樣品(pin)加入胰蛋白酶(mei)(mei)磷(lin)酸瓊脂中，并在其加入含有噬菌(jun)體敏感(gan)的(de)大(da)腸桿菌(jun)懸浮液(C-3000或(huo)K-12)。然后，混合(he)物會在胰蛋白酶(mei)(mei)磷(lin)酸瓊脂平板(ban)上(shang)分(fen)(fen)層，在36±2℃環境下孵育(yu)約24小(xiao)時(shi)后，觀察平板(ban)上(shang)溶(rong)菌(jun)斑的(de)形態。

生化特征檢測。

血紅(hong)蛋白檢測(ce)：所有批次的胎牛血清我(wo)們(men)都進行(xing)了(le)血紅(hong)蛋白的檢測(ce)，血紅(hong)蛋白含量低于(yu)《中國生物制品主要(yao)原輔(fu)材料指控指標》(2000年版)公布的指標。

效能檢測：其它血清

。檢測新生牛血(xue)(xue)清維持超過三代VERO細胞生長的(de)(de)能力。在每一個培(pei)養(yang)(yang)期，細胞都從初始(shi)孵育密度開始(shi)傳代培(pei)養(yang)(yang)。可將所得(de)結果(guo)與(yu)使(shi)用(yong)含有已知特征的(de)(de)參照(zhao)血(xue)(xue)清對照(zhao)生長培(pei)養(yang)(yang)基獲得(de)的(de)(de)平行結果(guo)進行比較(jiao)。

馬(ma)血(xue)清(qing)。每一(yi)批馬(ma)血(xue)清(qing)被檢測維持在含(han)有檢測批血(xue)清(qing)的(de)(de)對照(zhao)培(pei)養基(ji)上Sp2/0-Ag14(小鼠骨髓瘤(liu))細胞生(sheng)(sheng)長的(de)(de)能力。可將所得(de)結(jie)(jie)果(guo)與使用(yong)含(han)有已(yi)知特征的(de)(de)參照(zhao)血(xue)清(qing)對照(zhao)生(sheng)(sheng)長培(pei)養基(ji)獲得(de)的(de)(de)平行結(jie)(jie)果(guo)進行比較。

血(xue)清的(de)使用(yong)與儲存：正確的(de)使用(yong)及保存血(xue)清，才能使血(xue)清發揮應有的(de)作用(yong)。

1. 儲存(cun)條(tiao)件：血清(qing)一般儲存(cun)于(yu)－20℃，同時應(ying)避免反復凍融。購買(mai)大包裝的(de)血清(qing)后，先要滅活(huo)處理，然后分(fen)裝成(cheng)小包裝，儲存(cun)于(yu)－20℃，使(shi)用(yong)前融化。融化時好先置于(yu)4℃。融化后的(de)血清(qing)在4℃不(bu)宜(yi)長時間(jian)存(cun)放，應(ying)盡快(kuai)使(shi)用(yong)。

2. 使(shi)(shi)用濃度：自從有了合(he)成培養(yang)基，血清(qing)就是(shi)作為(wei)(wei)一種添加成分與合(he)成培養(yang)基混合(he)使(shi)(shi)用，使(shi)(shi)用濃度一般為(wei)(wei)5－20％，常(chang)用是(shi)10％。過(guo)多血清(qing)容易(yi)使(shi)(shi)培養(yang)中(zhong)的(de)(de)細胞(bao)發生變化，特別是(shi)一些(xie)二倍體(ti)的(de)(de)無限細胞(bao)系(xi)，迅速生長之后容易(yi)發生惡性轉化。

關于使用中的常見問題

1.保存血清好的辦法？
我們建(jian)議(yi)血清應保存在-5℃-20℃。若你一次無(wu)法(fa)用完(wan)一瓶，建(jian)議(yi)您無(wu)菌(jun)分裝血清恰當的滅(mie)菌(jun)容器(qi)內，再(zai)放回冷凍(dong)。

2.如何解凍血清才不會使產品質量受損？
我們(men)建議您將血清(qing)從冷凍箱(xiang)中(zhong)取出后(hou)，先置于2-8℃冰箱(xiang)中(zhong)使之(zhi)溶(rong)(rong)解(jie)，然后(hou)在室(shi)溫下使之(zhi)全(quan)溶(rong)(rong)。但必須注意(yi)的是，溶(rong)(rong)解(jie)過程中(zhong)必須規則地搖晃(huang)均勻。

3.血清解凍后發現有絮狀沉淀物出現，該如何處理？
血清中沉淀物的出現有許多原因，但普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性造成的；而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解凍后，也會存在于血清中，亦是造成血清沉淀物的主要原因之一。但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質量。
若(ruo)您(nin)欲去(qu)除這(zhe)些絮狀沉(chen)淀物，可以(yi)將血清分裝無菌離心(xin)(xin)管中，以(yi)400g稍微離心(xin)(xin)，上清液即可接著加(jia)入培養基內一起(qi)過(guo)濾(lv)(lv)。我(wo)們(men)不建議您(nin)以(yi)過(guo)濾(lv)(lv)的方(fang)法去(qu)除這(zhe)些絮狀沉(chen)淀物，因(yin)為它可能會阻(zu)塞您(nin)的過(guo)濾(lv)(lv)膜。

4.何謂熱滅活？有必要做熱滅活嗎？
一般以56℃，30分鐘水浴來處理已解凍的血清，因為此加熱步驟，可以使補體去活性，而補體所參與的反應有：溶細胞活性，平滑肌的收縮，肥大細胞和血小板組胺的釋放，增強吞噬作用，淋巴細胞、巨噬細胞的趨化和激活。實驗顯示，經過正確處理的熱滅活血清，對大多數的細胞而言是不需要的。經過處理的血清對細胞生長只有微小的促進，或*沒有任何作用，甚通常因為高溫處理影響了血清的質量，而造成細胞生長速率的降低。
而(er)經過(guo)熱處理的(de)血(xue)清(qing)(qing)，沉(chen)(chen)淀物(wu)的(de)形(xing)成會(hui)顯(xian)著的(de)增(zeng)多(duo)，這些沉(chen)(chen)淀物(wu)在倒置顯(xian)微(wei)鏡(jing)下觀察，像是“小黑點"，常常會(hui)讓研究者誤以(yi)為是血(xue)清(qing)(qing)遭(zao)受(shou)污染(ran)，而(er)把血(xue)清(qing)(qing)放在37℃環(huan)境(jing)中，又會(hui)使(shi)(shi)此沉(chen)(chen)淀物(wu)更增(zeng)多(duo)，使(shi)(shi)研究者認為是微(wei)生(sheng)物(wu)的(de)分裂擴增(zeng)。因此我們建議您(nin)，若非必須(xu)，您(nin)可(ke)以(yi)不(bu)需要做熱滅活這一步(bu)。如此以(yi)來，不(bu)但(dan)節省您(nin)寶貴(gui)的(de)時間，更確保您(nin)血(xue)清(qing)(qing)的(de)質(zhi)量！

5.如何避免沉淀物的出現？
我們建議您在使用(yong)血(xue)清(qing)(qing)的(de)時(shi)候，注意(yi)正確的(de)血(xue)清(qing)(qing)解凍步驟，并盡量(liang)避免滅活血(xue)清(qing)(qing)及長時(shi)間的(de)將血(xue)清(qing)(qing)置于高(gao)溫(wen)環(huan)境中。

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