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豚鼠外周血單核細胞分離液試劑盒
貨號：P8680
規格：2×200ml/KIT
保存 ：室(shi)溫避光儲存，有效期(qi)少 2 年。

豚鼠外周血單核細胞分離液試劑盒

操作步驟： 1. 取新(xin)鮮(xian)抗凝全血(xue)(xue)(xue)（EDTA、枸櫞(yuan)酸鈉(na)或(huo)肝素抗凝血(xue)(xue)(xue)均可）或(huo)者(zhe)去纖維蛋白(bai)血(xue)(xue)(xue)液(ye)(ye)，用(yong)(yong)等體(ti)積的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)全血(xue)(xue)(xue)及組織(zhi)稀釋(shi)(shi)液(ye)(ye)或(huo)者(zhe)PBS稀釋(shi)(shi)全血(xue)(xue)(xue)。 2. 取一(yi)支無菌離(li)(li)心(xin)(xin)(xin)(xin)管，先加入試(shi)(shi)(shi)(shi)劑(ji)(ji)(ji)A，再加入試(shi)(shi)(shi)(shi)劑(ji)(ji)(ji)D，使兩者(zhe)形成梯度界(jie)(jie)(jie)面(mian)(mian)（試(shi)(shi)(shi)(shi)劑(ji)(ji)(ji)A：試(shi)(shi)(shi)(shi)劑(ji)(ji)(ji)D的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)體(ti)積比為(wei)(wei)3：2，如稀釋(shi)(shi)后(hou)(hou)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)血(xue)(xue)(xue)液(ye)(ye)樣(yang)(yang)本(ben)(ben)小(xiao)于(yu)(yu)5ml，則先后(hou)(hou)加入3ml試(shi)(shi)(shi)(shi)劑(ji)(ji)(ji)A和(he)2ml試(shi)(shi)(shi)(shi)劑(ji)(ji)(ji)D；如稀釋(shi)(shi)后(hou)(hou)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)血(xue)(xue)(xue)液(ye)(ye)樣(yang)(yang)本(ben)(ben)大于(yu)(yu)5ml，試(shi)(shi)(shi)(shi)劑(ji)(ji)(ji)總(zong)量與稀釋(shi)(shi)后(hou)(hou)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)血(xue)(xue)(xue)液(ye)(ye)樣(yang)(yang)本(ben)(ben)量相(xiang)等），兩種(zhong)試(shi)(shi)(shi)(shi)劑(ji)(ji)(ji)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)(fen)(fen)(fen)層(ceng)(ceng)一(yi)定要(yao)清(qing)(qing)(qing)晰。 3. 將稀釋(shi)(shi)后(hou)(hou)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)血(xue)(xue)(xue)液(ye)(ye)平鋪到(dao)分(fen)(fen)(fen)(fen)離(li)(li)液(ye)(ye)液(ye)(ye)面(mian)(mian)上方，注意保持兩液(ye)(ye)面(mian)(mian)界(jie)(jie)(jie)面(mian)(mian)清(qing)(qing)(qing)晰。（可以使用(yong)(yong)巴氏德(de)吸管吸取血(xue)(xue)(xue)液(ye)(ye)，然后(hou)(hou)將血(xue)(xue)(xue)液(ye)(ye)小(xiao)心(xin)(xin)(xin)(xin)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)平鋪于(yu)(yu)分(fen)(fen)(fen)(fen)離(li)(li)液(ye)(ye)上，因為(wei)(wei)兩者(zhe)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)密度差異(yi)(yi)，將形成明顯(xian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)(fen)(fen)(fen)層(ceng)(ceng)界(jie)(jie)(jie)面(mian)(mian)。如果樣(yang)(yang)品較多，加樣(yang)(yang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)時間(jian)較長(chang)，在離(li)(li)心(xin)(xin)(xin)(xin)之(zhi)前出現紅(hong)(hong)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)成團下沉屬正常現象） 4. 室溫，水平轉子500~800g，離(li)(li)心(xin)(xin)(xin)(xin)20~30min（血(xue)(xue)(xue)液(ye)(ye)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)體(ti)積越大所需(xu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)離(li)(li)心(xin)(xin)(xin)(xin)力越大，離(li)(li)心(xin)(xin)(xin)(xin)時間(jian)越長(chang)，分(fen)(fen)(fen)(fen)離(li)(li)條件需(xu)自(zi)行(xing)摸索，離(li)(li)心(xin)(xin)(xin)(xin)轉速不超(chao)過1000g）。 5. 離(li)(li)心(xin)(xin)(xin)(xin)后(hou)(hou)將出現明顯(xian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)(fen)(fen)(fen)層(ceng)(ceng)： 層(ceng)(ceng)為(wei)(wei)血(xue)(xue)(xue)漿層(ceng)(ceng)；第二(er)層(ceng)(ceng)為(wei)(wei)白(bai)色單(dan)(dan)核(he)(he)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)層(ceng)(ceng)；第三(san)層(ceng)(ceng)為(wei)(wei)透明試(shi)(shi)(shi)(shi)劑(ji)(ji)(ji)D液(ye)(ye)層(ceng)(ceng)；第四層(ceng)(ceng)為(wei)(wei)半透明試(shi)(shi)(shi)(shi)劑(ji)(ji)(ji)A液(ye)(ye)層(ceng)(ceng)；第五(wu)層(ceng)(ceng)為(wei)(wei)紅(hong)(hong)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)層(ceng)(ceng)（如圖示）。 6. 小(xiao)心(xin)(xin)(xin)(xin)吸取第二(er)層(ceng)(ceng)試(shi)(shi)(shi)(shi)劑(ji)(ji)(ji)D層(ceng)(ceng)和(he)第三(san)層(ceng)(ceng)乳白(bai)色細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)層(ceng)(ceng)到(dao)另一(yi)無菌的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)15ml離(li)(li)心(xin)(xin)(xin)(xin)管中(zhong)，加入10mL細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)洗(xi)滌(di)液(ye)(ye)或(huo)PBS，顛倒混勻，250g，離(li)(li)心(xin)(xin)(xin)(xin)10min。 7. 棄上清(qing)(qing)(qing)，5mL的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)清(qing)(qing)(qing)洗(xi)液(ye)(ye)或(huo)PBS重(zhong)懸(xuan)(xuan)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)，250g，離(li)(li)心(xin)(xin)(xin)(xin)10min。 8. 重(zhong)復(fu)步驟7 9. 棄上清(qing)(qing)(qing)，細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)重(zhong)懸(xuan)(xuan)備用(yong)(yong)。 10. 差異(yi)(yi)貼(tie)(tie)壁法純(chun)(chun)化(hua)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)：用(yong)(yong)單(dan)(dan)核(he)(he)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)培養(yang)(yang)基以10 6個/ml的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)密度重(zhong)懸(xuan)(xuan)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)，將細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)鋪于(yu)(yu)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)板或(huo)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)瓶(ping)中(zhong)，置于(yu)(yu)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)培養(yang)(yang)箱(xiang)中(zhong)進行(xing)貼(tie)(tie)壁培養(yang)(yang)。 1) 2~4 h內(nei)貼(tie)(tie)壁的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)為(wei)(wei)單(dan)(dan)核(he)(he)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)。 2) 10~24 h內(nei)貼(tie)(tie)壁的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)單(dan)(dan)個核(he)(he)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)為(wei)(wei)內(nei)皮(pi)、內(nei)皮(pi)祖細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)、干細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao) 。 3) 不貼(tie)(tie)壁的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)為(wei)(wei)淋巴細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)。根據不同細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)貼(tie)(tie)壁時間(jian)存在差異(yi)(yi)，以達到(dao)簡單(dan)(dan)純(chun)(chun)化(hua)單(dan)(dan)核(he)(he)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)目的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)。此法成本(ben)(ben)低(di)，操作簡便。如需(xu)獲得高(gao)純(chun)(chun)度的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)目的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)則需(xu)選(xuan)用(yong)(yong)免疫磁珠分(fen)(fen)(fen)(fen)選(xuan)或(huo)者(zhe)是應用(yong)(yong)流(liu)式技(ji)術分(fen)(fen)(fen)(fen)選(xuan)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)。