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堿性磷酸酶染色液(偶氮偶聯法)

自備材料：
1、載玻片、濕盒
2、普通光學顯微鏡
產品簡介
       堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，簡稱 ALP 或 AKP)為一類磷酸酯酶，廣泛分布于哺乳動物組
織內，其活(huo)性(xing)所需適 pH 9.2~9.8。此(ci)酶(mei)主要存在于(yu)物質交換活(huo)躍之(zhi)(zhi)(zhi)處(細(xi)胞(bao)膜)，如腸上皮(pi)(pi)和腎近曲小管的刷狀緣、附睪上皮(pi)(pi)之(zhi)(zhi)(zhi)靜纖毛(mao)、肝的毛(mao)細(xi)膽(dan)管膜以(yi)(yi)及(ji)(ji)微動脈和毛(mao)細(xi)血(xue)管動脈部之(zhi)(zhi)(zhi)內皮(pi)(pi)，還見于(yu)內質網、高爾(er)基復合體(ti)、吞飲(yin)小泡(pao)、腸上皮(pi)(pi)之(zhi)(zhi)(zhi)溶(rong)酶(mei)體(ti)、中(zhong)性(xing)粒細(xi)胞(bao)之(zhi)(zhi)(zhi)中(zhong)性(xing)顆(ke)粒以(yi)(yi)及(ji)(ji)平滑肌之(zhi)(zhi)(zhi)細(xi)胞(bao)膜。不(bu)是(shi)(shi)采(cai)(cai)用金(jin)屬沉(chen)淀法來顯示堿性(xing)磷酸(suan)酶(mei)活(huo)性(xing)，而是(shi)(shi)采(cai)(cai)用偶(ou)氮偶(ou)聯法(又稱同時偶(ou)聯法)，其原理是(shi)(shi)在 pH9.2～9.8 的堿性(xing)條(tiao)件下，細(xi)胞(bao)內堿性(xing)磷酸(suan)酶(mei)可使 AB-BI 磷酸(suan)鹽水解(jie)，釋放出磷酸(suan)與萘酚，后者與偶(ou)聯重氮鹽生(sheng)成(cheng)有色產物，定位于(yu)細(xi)胞(bao)質中(zhong)。該染液(ye)可用于(yu)血(xue)液(ye)、骨髓或細(xi)胞(bao)涂片、冰(bing)凍切片、梯度入水后的石蠟切片等的堿性(xing)磷酸(suan)酶(mei)染色，堿性(xing)磷酸(suan)酶(mei)活(huo)性(xing)部位呈藍色，位于(yu)胞(bao)槳，結果較金(jin)屬鹽沉(chen)淀法可靠。

操作步驟：
一、涂片或切片
1、 血液、骨髓或細胞涂片、冰凍切片、石蠟切片入ALP固定液固定3min(梯度入水后的石蠟切片無需固定)，水洗。
2、 滴加配制好的 ALP 孵育液，放入濕盒中，避光孵育 15～20min，水洗。
3、 入核固紅染色液或甲基綠染色液復染 3～5min。
4、 水洗、鏡檢或甘油明膠封固后鏡檢。
二、貼壁培養細胞
1、 取6孔板或其他容器培養的細胞，棄液，PBS清洗干凈。
2、 加入ALP固定液固定3min或4%多聚甲醛固定10～15min，PBS清洗。
3、 滴加配制好的 ALP 孵育液，放入濕盒中，避光孵育 15～20min，PBS 清洗。
4、 入核固紅染色液或甲基綠染色液復染 3～5min。
5、 PBS 清洗、鏡檢。

染色結果：
ALP 活性部位 藍色
細胞核 紅色(核固紅)或綠色(甲基綠)
血液、骨髓涂片結果判斷：
一般以積分報告結果，根據 100 個中性粒細胞陽性顆粒進行 0-4 計分。
細胞分值 染色特點
0 無顆粒
1 稍有顆粒
2 中等程度顆粒
3 多數顆粒
4 充滿顆粒

注意事項：
1. 血液或骨髓細胞涂片或其他樣本均應新鮮，薄厚適宜，及時固定，否則會影響酶的活性。
2. 培養細胞染色操作過程中，清洗、染色等步驟都應輕微，以免損傷或丟失細胞。
3. ALP 孵育液易失效或降低陽性強度，即配即用，不宜久置。
4. 復染時，核固紅染色液或甲基綠染色液二者取其一。
5. 每次(ci)染色(se)時，應有陽(yang)性(xing)對照(zhao)片。

相關文獻：

《Hedgehog pathway inhibition causes primary follicle atresia and decreases female germline stem cell proliferation capacity or stemness》 作(zuo)者:Yu Jiang, Dantian Zhu, Wenfeng Liu, Qiushi Qin, Zhi Fang and Zezheng Pan 期刊:Stem Cell Research & Therapy 影(ying)響因(yin)子:4.627 PMID:31277696

堿性磷酸酶染色液(偶氮偶聯法)