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基因組omega質粒提取試劑盒
貨號：D6943-01
規格：100T/盒

基因組omega質粒提取試劑盒

產品簡介： 

試(shi)劑(ji)(ji)(ji)(ji)盒(he)采(cai)用(yong)酶(mei)法(fa)破(po)碎酵(jiao)(jiao)母細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)壁和堿裂解法(fa)裂解酵(jiao)(jiao)母細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)來提取酵(jiao)(jiao)母質粒 DNA。所采(cai)用(yong)的酵(jiao)(jiao)母破(po)壁酶(mei)能(neng)有(you)效(xiao)地破(po)壞酵(jiao)(jiao)母細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)壁，提高酵(jiao)(jiao)母質粒 DNA 的產量。吸附柱中采(cai)用(yong)的硅(gui)基質材料能(neng)高效(xiao)、專一(yi)地附 DNA，可(ke)(ke)限度去除(chu)雜質蛋(dan)白質及(ji)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)中其他有(you)機化合物。使用(yong)本試(shi)劑(ji)(ji)(ji)(ji)盒(he)提取的酵(jiao)(jiao)母質粒DNA可(ke)(ke)適用(yong)于各種常(chang)規的分子生物學(xue)實驗，包括(kuo)酶(mei)切、PCR、測序、連接和轉化等試(shi)驗。本試(shi)劑(ji)(ji)(ji)(ji)盒(he)無需使用(yong)酚等有(you)毒試(shi)劑(ji)(ji)(ji)(ji)，操作安全。 

操作步驟： 

使用(yong)前(qian)請先在漂洗液中加入無水(shui)乙醇，加入體積(ji)請參照瓶(ping)上的標簽。溶(rong)液YP1在使用(yong)前(qian)先加入RNaseA（將(jiang)試劑盒中提供的 RNaseA全部加入），混勻(yun)，置(zhi)于 2-8℃保存(cun)。如非指明，所有離心步驟均為(wei)使用(yong)臺(tai)式(shi)

離心(xin)機(ji)在室溫下離心(xin)。 

1、取1-5ml酵母培養(yang)物（不超過(guo) 5×107cells），12000rpm離心 1min，盡量吸除(chu)上清（菌(jun)(jun)液較(jiao)多時可以通過(guo)多次(ci)離心將(jiang)菌(jun)(jun)體(ti)沉淀收集到(dao)一個離心管中）。 

2、酵母細胞壁的(de)破除： 

A、酶法(fa)：向酵(jiao)母菌(jun)體(ti)中加(jia)入 470ul 山梨醇 Buffer，充(chong)分(fen)懸(xuan)浮(fu)菌(jun)體(ti)，加(jia)入 25ul 酵(jiao)母破(po)壁酶和 5ul β-巰基乙醇，充(chong)分(fen)混勻(yun)，30℃處理 1-2h，期(qi)間可顛倒離(li)心管混勻(yun)數次。12000rpm 離(li)心 1min，棄(qi)上清，收(shou)集沉淀(dian)(dian)。向沉淀(dian)(dian)中加(jia)入 250ul 溶液 YP1（請先(xian)檢查是否已加(jia)入 RNaseA） ，充(chong)分(fen)懸(xuan)浮(fu)沉淀(dian)(dian)。注意：如果(guo)菌(jun)塊(kuai)未*混勻(yun)，會(hui)影(ying)響(xiang)裂解(jie)導致質粒提取量和純(chun)度偏低。 

B、玻(bo)璃珠(zhu)法：向酵母菌體中(zhong)加入 250ul 溶液 YP1（請先檢查是否已加入 RNaseA） ，充(chong)分懸浮沉淀(dian)。加入 150-200ul酸洗(xi)玻(bo)璃珠(zhu)（自(zi)備(bei)），漩渦振蕩(dang) 10min。簡短離(li)心(xin)(xin)使玻(bo)璃珠(zhu)沉降到離(li)心(xin)(xin)管(guan)底(di)，吸取上清(qing)（如上清(qing)有(you)所損失(shi)，請用溶液 YP1 補足(zu) 250ul）于另(ling)一干凈(jing)離(li)心(xin)(xin)管(guan)中(zhong)。 

3、向離心管(guan)中(zhong)加入(ru) 250ul溶液(ye) YP2，溫和地上下(xia)翻轉 6-8 次使菌體充分(fen)裂解(jie)。注(zhu)意：混(hun)勻一(yi)定要溫和，以

免污染細菌基(ji)因組(zu) DNA，此(ci)時菌液(ye)應變得(de)清亮粘稠，作(zuo)用時間不要(yao)超過(guo) 5 min，以免質粒受(shou)到(dao)破壞(huai)。 

4、向離(li)心(xin)管中加入 350ul溶液(ye) YP3，立即溫和(he)地上下(xia)翻轉 6-8次(ci)，充分混勻，此時會出(chu)現(xian)白(bai)色絮狀沉(chen)淀(dian)。12000rpm離(li)心(xin) 10 min，用移液(ye)器小心(xin)地將上清(qing)轉移到另一個干凈的離(li)心(xin)管中，盡量不要吸出(chu)沉(chen)淀(dian)。注意：溶液(ye) YP3 加入后應立即混合(he)，避(bi)免產生(sheng)局部(bu)沉(chen)淀(dian)。如果上清(qing)中還(huan)有微小白(bai)色沉(chen)淀(dian)，可再次(ci)離(li)心(xin)后取上清(qing)。 

5、將上一(yi)步所得上清液加入吸(xi)附(fu)柱中(zhong)，室溫(wen)放置 2min，12000rpm 離心 1min，倒掉收(shou)集管(guan)中(zhong)的(de)廢液，吸(xi)附(fu)柱重(zhong)新放回收(shou)集管(guan)中(zhong)。 

6、向吸附(fu)(fu)柱中(zhong)(zhong)加(jia)入 700ul 漂(piao)洗液(ye)(使(shi)用(yong)前請先檢查是否已加(jia)入無水乙(yi)醇)，12000rpm 離心 1min，棄(qi)廢液(ye)，將吸附(fu)(fu)柱放入收集管中(zhong)(zhong)。 

7、向(xiang)吸附柱中加入(ru) 500ul漂(piao)洗液(ye)，12000rpm離(li)心(xin) 1min，棄廢液(ye)，將吸附柱放入(ru)收(shou)集(ji)管中。 

8、12000rpm 離心 2min，將(jiang)吸(xi)附(fu)柱敞口置于室溫或 50℃溫箱(xiang)放置數分鐘，目的是將(jiang)吸(xi)附(fu)柱中殘余的漂(piao)洗液去除，否(fou)則漂(piao)洗液中的乙醇會影響后續的實驗如酶(mei)切、PCR 等。 

9、將吸(xi)附(fu)柱放入一(yi)個干凈的(de)(de)離心管中，向(xiang)吸(xi)附(fu)膜中央懸空滴加(jia) 50-200ul 經(jing) 65℃水浴預熱的(de)(de)洗脫液(ye)，室溫放置 2min，12000rpm離心 1min。 

10、為了增加質粒的回收效(xiao)率，可將得到的洗脫液重新加入吸附柱中，室溫放置 2min， 12000rpm離心 1min。  

注意事(shi)項： 

1、使(shi)用前請先(xian)檢查(cha)溶液(ye) YP2 和溶液(ye) YP3 是否出現(xian)混(hun)濁(zhuo)，如有混(hun)濁(zhuo)現(xian)象，可(ke)在 37℃水浴中加熱幾分鐘，待溶液(ye)恢復澄清后再使(shi)用。 

2、洗(xi)脫緩沖液體積(ji)不應少(shao)于 50ul，體積(ji)過小影響回收效(xiao)率；洗(xi)脫液的(de) pH值(zhi)(zhi)對洗(xi)脫效(xiao)率也有(you)影響，若需要用水做洗(xi)脫液應保(bao)證(zheng)其 pH 值(zhi)(zhi)在 8.0 左右(可用 NaOH 將水的(de) pH 值(zhi)(zhi)調此范(fan)圍)，pH 值(zhi)(zhi)低于 7.0 會(hui)降低。洗(xi)脫效(xiao)率；DNA產物應保(bao)存在-20℃，以防 DNA降解。 

3、質(zhi)粒得率(lv)與酵母菌(jun)(jun)株、質(zhi)粒拷貝數、培養條件(jian)等因素有關。通(tong)常酵母質(zhi)粒拷貝數都很低，一般通(tong)過電泳(yong)或(huo)分光(guang)(guang)光(guang)(guang)度計(ji)法都很難檢測到，可通(tong)過 PCR或(huo)轉(zhuan)化大(da)腸桿菌(jun)(jun)來檢測。 

4、DNA濃(nong)度(du)及純(chun)度(du)檢(jian)測：得(de)到的基因組DN**段(duan)的大(da)小(xiao)與樣品保存時間、操(cao)作(zuo)過(guo)程中(zhong)的剪切力(li)等因素有關。回收得(de)到的DN**段(duan)可用(yong)(yong)瓊脂(zhi)糖凝膠電泳和紫外分(fen)光(guang)光(guang)度(du)計(ji)檢(jian)測濃(nong)度(du)與純(chun)度(du)。DNA應在(zai)OD260處有顯著吸(xi)收峰， OD260值為(wei) 1 相當于大(da)約 50  μg/ml雙鏈(lian)DNA、40  μg/ml單鏈(lian)DNA。OD260/OD280比值應為(wei)1.7-1.9，如(ru)果洗(xi)脫時不使(shi)用(yong)(yong)洗(xi)脫緩沖液(ye)，而使(shi)用(yong)(yong)去離(li)子水(shui)，比值會偏低，因為(wei)pH值和離(li)子存在(zai)會影響光(guang)吸(xi)收值，但(dan)并不表示純(chun)度(du)低。