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Human IL-12/IL-23p40 Elisa試劑盒

人白細胞介素12 ELISA 試劑盒
產品編號：SEKH-0020
適用于人血清、血漿或細胞培養上清液等樣本

背景介紹：
      IL-12 是(shi)由二(er)硫鍵相連異源二(er)聚(ju)體(ti)(ti)(ti)(ti)，70kDa 的(de)(p70)異二(er)聚(ju)體(ti)(ti)(ti)(ti)糖(tang)蛋白由 40kDa(p40)和(he)(he) 35kDa (p35)兩個(ge)(ge)亞(ya)(ya)基(ji)(ji)組成(cheng)。p40 和(he)(he) p35 亞(ya)(ya)基(ji)(ji)沒有(you) IL-12 的(de)活(huo)性(xing)，只有(you)異二(er)聚(ju)體(ti)(ti)(ti)(ti) IL-12p70 才具有(you) IL-12 生(sheng)物學活(huo)性(xing)，IL-12p40 同型二(er)聚(ju)體(ti)(ti)(ti)(ti)可(ke)與 IL-12 的(de)受體(ti)(ti)(ti)(ti)結合，是(shi) IL-12 的(de)拮抗劑。人(ren) IL-12 P35 亞(ya)(ya)單(dan)位(wei)有(you) 197 個(ge)(ge)氨基(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)殘基(ji)(ji),含(han) 7 個(ge)(ge) 半胱(guang)氨酸(suan)(suan)(suan)和(he)(he) 3 個(ge)(ge) N 糖(tang)基(ji)(ji)化(hua)位(wei)點，P40 亞(ya)(ya)單(dan)位(wei)有(you) 306 個(ge)(ge)氨基(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)殘基(ji)(ji)，含(han) 10 個(ge)(ge)半胱(guang)氨酸(suan)(suan)(suan)和(he)(he) 4 個(ge)(ge) N 糖(tang)基(ji)(ji)化(hua)位(wei)點。 人(ren)類 p40 和(he)(he) p35 分別在染(ran)色體(ti)(ti)(ti)(ti) 5 和(he)(he) 3 上。P40 與 IL-6 受體(ti)(ti)(ti)(ti)、睫狀神經營養因(yin)(yin)子(CNTF)受體(ti)(ti)(ti)(ti)、G-CSF 受體(ti)(ti)(ti)(ti)有(you) 同源性(xing)，具有(you)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)因(yin)(yin)子受體(ti)(ti)(ti)(ti)家族的(de)特(te)征。IL-12 也(ye)被稱為自然殺傷細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)刺激因(yin)(yin)子（NKSF）或(huo)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)毒性(xing)淋(lin)巴細(xi)(xi) 胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)成(cheng)熟因(yin)(yin)子（CLMF），是(shi)由抗原提成(cheng)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)（單(dan)核/巨噬(shi)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、樹突狀細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)核 B 細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)）產的(de)多(duo)效(xiao)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)因(yin)(yin)子，可(ke) 作(zuo)用(yong)于 T 細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)和(he)(he) NK 細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)，促進其增殖(zhi)、細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)毒性(xing)、細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)因(yin)(yin)子產生(sheng)和(he)(he) Th1 亞(ya)(ya)群的(de)發育。

檢測原理：
      Solarbio ELISA試(shi)劑盒采(cai)用基于雙抗(kang)(kang)(kang)體夾心(xin)法的(de)(de)(de)(de)酶(mei)聯(lian)免疫吸(xi)(xi)附檢(jian)測(ce)技術。將抗(kang)(kang)(kang)人(ren)IL-12 單克隆抗(kang)(kang)(kang)體包(bao)(bao)(bao)被在酶(mei)標板上(shang)；分別加入梯度(du)稀釋的(de)(de)(de)(de)標準品(pin)(pin)和預(yu)稀釋的(de)(de)(de)(de)樣(yang)(yang)本，標準品(pin)(pin)和樣(yang)(yang)本中(zhong)的(de)(de)(de)(de)人(ren) IL-12 會與酶(mei)標板上(shang)的(de)(de)(de)(de)包(bao)(bao)(bao)被抗(kang)(kang)(kang)體充分結(jie)合；洗(xi)板后加入生物(wu)素(su)化抗(kang)(kang)(kang)人(ren) IL-12 抗(kang)(kang)(kang)體，該抗(kang)(kang)(kang)體 會與板子上(shang)包(bao)(bao)(bao)被抗(kang)(kang)(kang)體捕獲(huo)的(de)(de)(de)(de)標準品(pin)(pin)和樣(yang)(yang)本中(zhong)的(de)(de)(de)(de)人(ren) IL-12發生特(te)異性結(jie)合；洗(xi)板后加入辣根過氧化物(wu) 酶(mei)（HRP）標記的(de)(de)(de)(de)鏈(lian)霉(mei)親(qin)和素(su)，生物(wu)素(su)與鏈(lian)霉(mei)親(qin)和素(su)會發生高強度(du)的(de)(de)(de)(de)非(fei)共價結(jie)合；洗(xi)板后加入顯色劑底(di)物(wu) TMB，若反應(ying)孔中(zhong)樣(yang)(yang)品(pin)(pin)存在不同濃度(du)的(de)(de)(de)(de)人(ren) IL-12，則 HRP 會使無色 TMB 變(bian)成不同深淺(qian)（正(zheng)相關） 的(de)(de)(de)(de)藍色物(wu)質，加入終止液后反應(ying)孔會變(bian)成黃(huang)色；后，在λmax=450 nm（OD=450 nm）處測(ce)定(ding)反應(ying)孔樣(yang)(yang)品(pin)(pin)吸(xi)(xi) 光(guang)度(du)（OD），樣(yang)(yang)本中(zhong)的(de)(de)(de)(de)人(ren) IL-12 濃度(du)與 OD 成正(zheng)比，通過繪制標準曲線和四(si)參(can)數擬合軟件(jian)便可計算(suan) 出樣(yang)(yang)本中(zhong)人(ren) IL-12的(de)(de)(de)(de)濃度(du)。

原理圖：

注意事項：
1. 試劑盒應在有效期內使用，請不要使用過期的試劑。
2. 試劑盒未使用時應保存在 2-8℃冰箱，已復溶但未用完的標準品，請丟棄。
3. 試劑盒使用前請在室溫恢復 30 min，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品。
4. 在試驗中標準品和樣本建議作復孔檢測，且加入試劑的順序應保持一致。
5. 為避(bi)免交叉污(wu)染，請在試驗中(zhong)使用(yong) 1 次性(xing)試管，槍頭(tou)，封板膜（※）及潔(jie)凈塑料容器(qi)。

6. 濃縮生物素化抗體和濃縮酶結合物的體積較少，在運輸過程中微量液體會沾到管壁及瓶蓋上，使用前請離心處理（5-10 S 即可），使管壁上的液體集中在管底部，取用時，請用移液器小心吹打幾次。
7. 除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外，請不要使用其他來源試劑盒內含的試劑代替本試劑盒中的某單個組分。
8. 為(wei)保證結果準確，每次(ci)檢測均需做(zuo)標準曲(qu)線。

安全提示：
試劑盒中的終止液為酸性溶液，操作人員在使用時請帶上手套并注意防護；在操作過程中也要避免試
劑接觸皮膚和眼睛，如果不慎接觸，請用大量清水清洗；檢測血液樣本及其它體液樣本時，請按國家生物
實驗室安(an)全防護有關管理規定(ding)執行(xing)。

自備實驗器材（不提供，可代購）
1． 酶標儀（主波長 450nm，參考波長 630nm）
2． 高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl
3． 洗板機或洗瓶
4． 37℃孵育箱
5． 雙蒸水，去離子水，量筒等
6． 稀(xi)釋用聚丙烯試管(guan)

樣本收集及儲存：
1. 細胞培養上清：
將細胞培養基移無菌離心管，在 4℃條件下 1000 ×g 離心 10 min,然后將上清等量分裝于小 EP 管于-20℃下保存（24 小時內檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復凍融。
2. 血清樣本：
室溫血液自然凝固 20 min 后，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于
-20℃下保存（24 小時內檢測可放入 2-8℃儲存），保存過程中如有沉淀，請再次離心，避免反復凍融。
3. 血漿樣本：
將全血收集到含抗血凝劑的管中，根據標本的實際要求選擇 EDTA，檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合 20 min ，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24小時內檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復凍融。
※注意：血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本，以免影響檢測結果；如果樣本中的靶標物檢測濃度高
于標準(zhun)品的高(gao)值，請將樣品做適當倍數(shu)稀(xi)釋(shi)后檢測，建議(yi)正式實驗前做預實驗以(yi)確定稀(xi)釋(shi)倍數(shu)。

試劑準備：
1. 試劑回溫：先在實驗前 30 min 將試劑盒，待測樣本放置于室溫下，濃縮洗滌液如出現結晶，請放入
37℃溫浴直到結晶全部溶解。
2. 配制洗滌液：預先計算好稀釋后的洗滌液使用體積，然后用雙蒸水或去離子水將 20 倍濃縮洗滌液稀釋成 1 倍應用液，未用完的濃縮洗滌液放入 4℃冰箱保存。
3. 標(biao)準(zhun)品(pin)梯度稀(xi)(xi)(xi)(xi)釋(shi)：加(jia)入(ru)(ru)標(biao)準(zhun)品(pin)/樣本稀(xi)(xi)(xi)(xi)釋(shi)液(ye)（SR1）1ml凍干標(biao)準(zhun)品(pin)中，靜置15分鐘(zhong)待(dai)其(qi)*溶解后輕 輕混勻(濃度為(wei)4000pg/ml)，然后在(zai)其(qi)余七(qi)管(guan)中各加(jia)入(ru)(ru)500?1?78?1?76L標(biao)準(zhun)品(pin)/樣本稀(xi)(xi)(xi)(xi)釋(shi)液(ye)（SR1），按(an)照(zhao)以(yi)下(xia)濃度 進(jin)(jin)行(xing)2倍(bei)稀(xi)(xi)(xi)(xi)釋(shi)：4000、2000、1000、500、250、125、62.5、0 pg/ml進(jin)(jin)行(xing)稀(xi)(xi)(xi)(xi)釋(shi)。4000pg/ml標(biao)準(zhun)曲線(xian)高點(dian) 濃度，標(biao)準(zhun)品(pin)/樣本稀(xi)(xi)(xi)(xi)釋(shi)液(ye)（SR1）作(zuo)為(wei)標(biao)準(zhun)曲線(xian)的零(ling)點(dian)（0pg/ml）。復溶過(guo)的標(biao)準(zhun)品(pin)原(yuan)液(ye)（4000pg/ml） 未用完的應廢(fei)棄或根據需要按(an)照(zhao)一次用量分裝，并將其(qi)貯存在(zai)-20～-80℃冰箱(xiang)，具體如下(xia)圖(tu)。

4. 生物素化抗體工(gong)作液(ye)：預先(xian)計算好(hao)試驗所需用量，用檢測(ce)稀(xi)釋液(ye)（SR2）將100倍抗體濃縮液(ye)稀(xi)釋成1倍

應(ying)用工作液（稀釋前充分(fen)混勻），請在(zai)30分(fen)鐘內加入(ru)到(dao)反應(ying)孔中。

5. 酶(mei)結合物工作(zuo)液：按(an)每次試驗所(suo)需用量配(pei)制，用酶(mei)結合物稀(xi)釋(shi)(shi)液（SR3）將(jiang)100倍濃縮(suo)酶(mei)結合物稀(xi)釋(shi)(shi)成1 倍應用工作(zuo)液（稀(xi)釋(shi)(shi)前離心），請(qing)在30分鐘內(nei)使用。

6. 洗滌(di)方法： 

自動洗板：甩盡酶標板孔中(zhong)液(ye)體，在厚迭吸水紙上拍干，注(zhu)入洗滌液(ye)為(wei) 300ul/孔,注(zhu) 與吸出間(jian)隔(ge)為(wei) 30 秒，洗板 5 次。 

手(shou)工洗板：甩盡酶(mei)標板孔(kong)(kong)(kong)中(zhong)液體(ti)(ti)，在厚(hou)迭(die)吸水紙上(shang)拍干(gan)(gan)，用洗瓶加入洗滌液 300ul/孔(kong)(kong)(kong)，靜止(zhi) 30 秒后(hou)甩 凈酶(mei)標板孔(kong)(kong)(kong)中(zhong)液體(ti)(ti)，在厚(hou)迭(die)的吸水紙上(shang)拍干(gan)(gan)，洗板 5 次。

結果判斷：

1.用酶標儀 450 nm 波長(chang)(chang)測定(ding) OD 值(zhi)。選(xuan)擇雙波長(chang)(chang)檢測，參考(kao)波長(chang)(chang)為 630 nm。如(ru)不(bu)能(neng)進(jin)行(xing)雙波長(chang)(chang)檢測，請 用 450 nm 的 OD 測定(ding)值(zhi)減去(qu) 630 nm 的 OD 測定(ding)值(zhi)。

2.計算標準(zhun)品(pin)、樣品(pin)的平均 OD 值(zhi)：每個標準(zhun)品(pin)和標本的 OD 值(zhi)應減去(qu)零(ling)孔的 OD 值(zhi)

3.以標(biao)準(zhun)品(pin)濃度為橫坐標(biao)，吸光度OD值(zhi)為縱坐標(biao)，用軟件繪制標(biao)準(zhun)曲線，樣品(pin)中IL-12含量可通(tong)過對應(ying)OD 值(zhi)由標(biao)準(zhun)曲線換(huan)算出相應(ying)的濃度。

4.若標(biao)本 OD 值高于標(biao)準曲線(xian)上(shang)限，應做(zuo)適當稀釋(shi)后重(zhong)新檢(jian)測(ce)，計算濃度時再乘以(yi)稀釋(shi)倍(bei)數。

1. 數據及標準曲線

本圖僅供參考，應以當次試驗標準品繪制的標準曲線計算人 IL-12 的樣本含量

 

2. 靈敏度：
低可檢測人 IL-12 濃度達 30pg/ml，
20 個(ge)零標準(zhun)品濃度(du) OD 的平均值加(jia)上兩(liang)個(ge)標準(zhun)差，計算相(xiang)應的可檢測濃度(du)。

3. 特異性：
不(bu)與(yu)人 IL-6、IL-6 Rα、IL-12、IL-12 Rβ1、IL-12 Rβ2、IL-23 R 反應(ying)(ying)，小鼠 IL-12 IL-12/IL-23 p40、IL-12/IL-23 p40 Homodimer、IL-12/IL-23 p40 Monomer、IL-12 p70、IL-12 Rβ、IL-12 Rβ2、IL-23、IL-23 p19、IL-23 R、 等反應(ying)(ying)。

4. 重復性：
板內，板間變(bian)異(yi)系數<10%。

5. 回收率：
在選取的健康人(ren)血漿、細胞培養上清中加入 3 個不同濃度水平(ping)的人(ren) IL-12，計算回收(shou)率(lv)。

6. 線性稀釋：

分別在(zai)選(xuan)取的 4 份健康人(ren)血(xue)漿和細胞培(pei)養上清中加入高濃度(du)人(ren) IL-6，在(zai)標準曲線(xian)動力學范圍內進行稀 釋，評估線(xian)性。

 

參考文獻：
《Targeted gene therapy of the HSV-TK/hIL-12 fusion gene controlled by the hSLPI gene promoter of human non-small cell lung cancer in vitro》 作者:Shuhong Hao Xiaoyuan Du Yang Song Ming Ren Qiwei Yang Ao Wang Qingyu Wang Haiyue Zhao Zhenwu Du Guizhen Zhang 期刊(kan):oncology letters 影響因(yin)子:1.871 PMID:29731853

Human IL-12/IL-23p40 Elisa試劑盒