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IPTG 異丙基-β-D-硫代半乳(ru)糖苷(gan) 基因(yin)工程：IPTG為(wei)(wei)安慰性誘導物(wu)，X-gal為(wei)(wei)生色底物(wu)，二者共同用(yong)于藍白(bai)(bai)斑篩選。IPTG可(ke)(ke)誘導載體lac操(cao)縱子DNA區段(duan)合成(cheng)β-半乳(ru)糖苷(gan)酶(mei)氨基端片段(duan)，該片段(duan)可(ke)(ke)與宿主細胞(bao)編碼的(de)(de)缺陷(xian)型β-半乳(ru)糖苷(gan)酶(mei)實現基因(yin)內(nei)互(hu)補(α互(hu)補)。實現α互(hu)補的(de)(de)細菌(jun)暴露(lu)IPTG，鋪在含有X-gal生色底物(wu)的(de)(de)培養基上，可(ke)(ke)形成(cheng)藍色菌(jun)落。外源DNA插入質粒的(de)(de)多克隆位點后可(ke)(ke)破壞α互(hu)補作用(yong),將產生白(bai)(bai)色菌(jun)落。

異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一(yi)種(zhong)作用*的誘(you)(you)導(dao)劑(ji)(ji)，不被細(xi)菌代謝而十分穩(wen)定，因此被實驗(yan)室廣泛應用。當有乳(ru)糖存在(zai)時，lac操(cao)(cao)縱子(zi)(zi)(zi)（元）即可被誘(you)(you)導(dao)。在(zai)這個操(cao)(cao)縱子(zi)(zi)(zi)（元）體(ti)系中，真正的誘(you)(you)導(dao)劑(ji)(ji)并(bing)非(fei)乳(ru)糖本身(shen)。乳(ru)糖進入細(xi)胞，經b－半乳(ru)糖苷酶催化(hua)，轉變為(wei)半乳(ru)糖。后者作為(wei)一(yi)種(zhong)誘(you)(you)導(dao)劑(ji)(ji)分子(zi)(zi)(zi)結合阻遏蛋(dan)白(bai)，使蛋(dan)白(bai)構象變化(hua)，導(dao)致阻遏蛋(dan)白(bai)與O序(xu)列解離、發生轉錄(lu)。

材料

1、誘(you)導表達材料

( 1 ) LB （Luria—Bertani）)培養基酵(jiao)母膏(gao) (Yeast extract) 5g 蛋白胨(dong) (Peptone) 10g

NaCl 10g 瓊脂(zhi) (Agar) 1-2%

蒸餾水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0

適用范圍：大(da)腸(chang)桿菌

( 2 ) IPTG 貯備液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸餾水中，0 . 22 μm 濾膜過濾除菌，分裝成1 mL /份，－20 ℃ 保存。

( 3 ) l× 凝膠電泳加樣緩沖液：

50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )

50 mmol / L DTT

2 % SDS （電泳(yong)級）

0.1 ％ 溴酚藍

10 ％ 甘油

2、大腸桿菌包涵體的分離與蛋白純化材料(liao)

1 ）酶溶法

（1）裂解緩沖液：

50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )

1 mmol / L EDTA

100 mmol / LNaCI

（2）50 mmol / L PMSF

（3）10 mg / mL 溶(rong)菌酶(mei)。

（4）脫氧(yang)膽酸。

（5）1 mg / mL DNase I。2 ）超(chao)聲破碎法

( 1 ) TE 緩(huan)沖液(ye)。

( 2 ) 2×SDS -PAGE 凝膠(jiao)電泳加樣緩沖液：

100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )

100 mmol / L DTT

4 %SDS

0.2 ％ 溴酚藍(lan)

20 ％ 甘油

IPTG 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷 基因工程實驗方案(an)

1、外源基因的(de)誘導表(biao)達

( 1 ）用(yong)適當的限制(zhi)性內切核酸酶消化載體DNA 和目的基因。

( 2 ）按連(lian)接(jie)步驟連(lian)接(jie)目(mu)的基因和載(zai)體，并轉化到相應的宿主(zhu)菌。

( 3 ）篩選出含(han)重組(zu)子的轉化(hua)菌(jun)落，提取質粒(li)DNA 作限制性(xing)內切核酸酶(mei)圖譜，DNA 序列測定確定無誤后進(jin)行(xing)下一步。

( 4 ）如果表達載體的原核啟動子為PL 啟動子，則在30 -32 ℃ 培養數小時，使培養液的OD600達0.4-0.6 ，迅速使溫度升42 ℃ 繼續培養3 -5h ；如果表達載體的原核啟動子為tac 等，則37 ℃培養細菌數小時達到對數生長期后加IPTG 終濃度為1 mmol / L。繼續培養3 -5h 。

( 5 ）取(qu)上(shang)(shang)述(shu)培養液(ye)(ye)1 mL , 1000g 離心，1 min ，沉淀，加100 μL 聚丙烯酰胺凝膠電泳(yong)上(shang)(shang)樣緩(huan)沖(chong)液(ye)(ye)后，作SDS -PAGE 檢(jian)測。

2、大腸(chang)桿菌(jun)包涵體的分離(li)與蛋(dan)白質(zhi)純化(hua)

1 ）細菌(jun)的裂解

常用方(fang)法(fa)(fa)(fa)有(you)：① 高溫珠磨法(fa)(fa)(fa)；② 高壓勻漿；③ 超(chao)聲(sheng)破碎法(fa)(fa)(fa)；④ 酶溶(rong)法(fa)(fa)(fa)；⑤ 化學滲透等。前(qian)三種方(fang)法(fa)(fa)(fa)屬機械(xie)破碎法(fa)(fa)(fa)，并(bing)且方(fang)法(fa)(fa)(fa)① 、② 已在工(gong)業生產中得(de)到應用，后三種方(fang)法(fa)(fa)(fa)在實(shi)驗室研究中應用較(jiao)為廣泛。下面(mian)介紹酶溶(rong)法(fa)(fa)(fa)和超(chao)聲(sheng)破碎法(fa)(fa)(fa)的實(shi)驗步驟。

（1）酶溶法。常用(yong)的溶解酶有溶菌酶；β-1,3 -葡聚糖(tang)(tang)酶；β-1,6 -葡聚糖(tang)(tang)酶；蛋白酶；殼多糖(tang)(tang)酶；糖(tang)(tang)昔酶等(deng)。溶菌酶主要對細菌類有作(zuo)用(yong)，而其他幾(ji)種酶對酵母作(zuo)用(yong)顯著。

IPTG 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷 基因工程主要步驟(zou)為(wei)：

① 4 ℃ ，5000rpm 離(li)心，15 min ，收集誘導(dao)表達的細菌培養液（100 mL ）。棄上清，約(yue)每克濕菌加3 mL 裂(lie)解緩沖液，懸浮(fu)沉(chen)淀(dian)。

注意事項：培養(yang)噬菌(jun)體時，Top agar中的添加量為(wei)：25 μl/3 ml(24 mg/ml)。含有IPTG的培養基4℃避光保存，須在1~2 周內使用。

保存：IPTG要2-8°C冷藏保存，配制好后保存于-20°C，室溫可放置一個月。遠離熱源及氧化劑。