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Human IL-6 ELISA試劑盒

人白細胞介素6ELISA 試劑盒
產品編號：SEKH-0013
適用于人血清、血漿或細胞培養上清液等樣本

背景介紹：
     白細(xi)(xi)胞(bao)(bao)介素 6(IL-6)是一(yi)種(zhong)由淋(lin)巴、非淋(lin)巴細(xi)(xi)胞(bao)(bao)產生的(de)多(duo)功(gong)能細(xi)(xi)胞(bao)(bao)因子。人 IL-6 的(de) cDNA 序列有(you) 212 個(ge) 氨基(ji)酸殘(can)基(ji)，含兩(liang)個(ge)潛在(zai)的(de) N -糖(tang)基(ji)化位點。成(cheng)熟 IL-6 由疏水 N 末端 28 個(ge)氨基(ji)酸殘(can)基(ji)信號肽裂解(jie)產生，含 184 氨基(ji)酸殘(can)基(ji)，其(qi)中有(you)四個(ge)半胱氨酸殘(can)基(ji)，分子量(liang)為 21 kDa。IL-6 由多(duo)種(zhong)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)產生，對免(mian)疫(yi)應答、急性(xing) 期(qi)反應、造血(xue)(xue)和神經系(xi)統(tong)有(you)多(duo)方(fang)面作用。IL-6 的(de)生物學活性(xing)主要包括 6 個(ge)方(fang)面：調(diao)節免(mian)疫(yi)應答、調(diao)節造血(xue)(xue) 系(xi)統(tong)、誘導急性(xing)期(qi)蛋白、調(diao)節腫瘤生長、調(diao)節神經內分泌系(xi)統(tong)和其(qi)它(ta)。

檢測原理：
      Solarbio (Solarbio ®) ELISA 試劑(ji)盒采用基(ji)于雙(shuang)抗(kang)體(ti)夾(jia)心法的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)酶聯免(mian)疫吸(xi)附檢(jian)測技(ji)術。將抗(kang)人(ren)(ren)(ren) IL-6 單克 隆(long)抗(kang)體(ti)包(bao)(bao)被在(zai)酶標(biao)(biao)(biao)板(ban)上；分(fen)別加入梯度(du)稀(xi)釋(shi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)標(biao)(biao)(biao)準品(pin)和(he)(he)預(yu)稀(xi)釋(shi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)樣(yang)(yang)本(ben)，標(biao)(biao)(biao)準品(pin)和(he)(he)樣(yang)(yang)本(ben)中的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)人(ren)(ren)(ren) IL-6 會與(yu)(yu)酶標(biao)(biao)(biao) 板(ban)上的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)包(bao)(bao)被抗(kang)體(ti)充分(fen)結(jie)合(he)；洗(xi)(xi)板(ban)后加入生物(wu)(wu)(wu)素(su)化抗(kang)人(ren)(ren)(ren) IL-6 抗(kang)體(ti)，該抗(kang)體(ti)會與(yu)(yu)板(ban)子上包(bao)(bao)被抗(kang)體(ti)捕獲(huo)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)標(biao)(biao)(biao)準品(pin) 和(he)(he)樣(yang)(yang)本(ben)中的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)人(ren)(ren)(ren) IL-6 發(fa)生特異(yi)性結(jie)合(he)；洗(xi)(xi)板(ban)后加入辣根過氧化物(wu)(wu)(wu)酶（HRP）標(biao)(biao)(biao)記的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)鏈(lian)(lian)霉(mei)親和(he)(he)素(su)，生物(wu)(wu)(wu)素(su)與(yu)(yu)鏈(lian)(lian) 霉(mei)親和(he)(he)素(su)會發(fa)生高強度(du)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)非共(gong)價(jia)結(jie)合(he)；洗(xi)(xi)板(ban)后加入顯色劑(ji)底物(wu)(wu)(wu) TMB，若反應(ying)孔中樣(yang)(yang)品(pin)存在(zai)不同(tong)濃度(du)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)人(ren)(ren)(ren) IL-6， 則 HRP 會使無色 TMB 變成不同(tong)深淺（正相關）的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)藍色物(wu)(wu)(wu)質(zhi)，加入終止(zhi)液(ye)后反應(ying)孔會變成黃(huang)色；后，在(zai) λmax=450 nm（OD=450 nm）處測定(ding)反應(ying)孔樣(yang)(yang)品(pin)吸(xi)光度(du)（OD），樣(yang)(yang)本(ben)中的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)人(ren)(ren)(ren) IL-6 濃度(du)與(yu)(yu) OD 成正比(bi)，通過 繪(hui)制標(biao)(biao)(biao)準曲線(xian)和(he)(he)四參數擬(ni)合(he)軟件便可計算出樣(yang)(yang)本(ben)中人(ren)(ren)(ren) IL-6 的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)濃度(du)。

原理圖：

注意事項：
1. 試劑盒應在有效期內使用，請不要使用過期的試劑。
2. 試劑盒未使用時應保存在 2-8℃冰箱，已復溶但未用完的標準品，請丟棄。
3. 試劑盒使用前請在室溫恢復 30 min，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品。
4. 在試驗中標準品和樣本建議作復孔檢測，且加入試劑的順序應保持一致。
5. 為避免交叉污染，請在(zai)試驗中使用 1 次性(xing)試管，槍(qiang)頭(tou)，封板膜（※）及潔凈塑(su)料容器。

6. 濃縮生物素化抗體和濃縮酶結合物的體積較少，在運輸過程中微量液體會沾到管壁及瓶蓋上，使用前請離心處理（5-10 S 即可），使管壁上的液體集中在管底部，取用時，請用移液器小心吹打幾次。
7. 除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外，請不要使用其他來源試劑盒內含的試劑代替本試劑盒中的某單個組分。
8. 為保證結果準確(que)，每次(ci)檢(jian)測均需做標準曲線(xian)。

安全提示：
試劑盒中的終止液為酸性溶液，操作人員在使用時請帶上手套并注意防護；在操作過程中也要避免試
劑接觸皮膚和眼睛，如果不慎接觸，請用大量清水清洗；檢測血液樣本及其它體液樣本時，請按國家生物
實驗室安全防護(hu)有關管理(li)規(gui)定(ding)執行(xing)。

自備實驗器材（不提供，可代購）
1． 酶標儀（主波長 450nm，參考波長 630nm）
2． 高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl
3． 洗板機或洗瓶
4． 37℃孵育箱
5． 雙蒸水，去離子水，量筒等
6． 稀釋用(yong)聚丙烯試管(guan)

樣本收集及儲存：
1. 細胞培養上清：
將細胞培養基移無菌離心管，在 4℃條件下 1000 ×g 離心 10 min,然后將上清等量分裝于小 EP 管于-20℃下保存（24 小時內檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復凍融。
2. 血清樣本：
室溫血液自然凝固 20 min 后，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于
-20℃下保存（24 小時內檢測可放入 2-8℃儲存），保存過程中如有沉淀，請再次離心，避免反復凍融。
3. 血漿樣本：
將全血收集到含抗血凝劑的管中，根據標本的實際要求選擇 EDTA，檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合 20 min ，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24小時內檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復凍融。
※注意：血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本，以免影響檢測結果；如果樣本中的靶標物檢測濃度高
于標(biao)準品的(de)高(gao)值，請將樣品做適當(dang)倍數稀釋(shi)后檢測，建議(yi)正式實驗(yan)前做預實驗(yan)以確定(ding)稀釋(shi)倍數。

試劑準備：
1. 試劑回溫：先在實驗前 30 min 將試劑盒，待測樣本放置于室溫下，濃縮洗滌液如出現結晶，請放入
37℃溫浴直到結晶全部溶解。
2. 配制洗滌液：預先計算好稀釋后的洗滌液使用體積，然后用雙蒸水或去離子水將 20 倍濃縮洗滌液稀釋成 1 倍應用液，未用完的濃縮洗滌液放入 4℃冰箱保存。
3. 標(biao)(biao)準品(pin)梯度稀(xi)釋(shi)：加(jia)入標(biao)(biao)準品(pin)/樣(yang)本稀(xi)釋(shi)液(ye)（SR1）1ml凍干標(biao)(biao)準品(pin)中，靜置15分鐘(zhong)待(dai)其(qi)*溶解(jie)后(hou)輕 輕混(hun)勻(濃度為(wei)(wei)1000pg/ml)，然后(hou)在其(qi)余七管中各加(jia)入500?1?78?1?76L標(biao)(biao)準品(pin)/樣(yang)本稀(xi)釋(shi)液(ye)（SR1），按照(zhao)以下(xia)濃度 進行(xing)2倍稀(xi)釋(shi)：500、250、125、62.5、31.25、15.62、7.81 pg/ml進行(xing)稀(xi)釋(shi)。500pg/ml為(wei)(wei)標(biao)(biao)準曲線高(gao)點(dian) 濃度，標(biao)(biao)準品(pin)/樣(yang)本稀(xi)釋(shi)液(ye)（SR1）作為(wei)(wei)標(biao)(biao)準曲線的零點(dian)（0pg/ml）。復(fu)溶過的標(biao)(biao)準品(pin)原液(ye)（1000pg/ml） 未用完的應廢棄或根據需要按照(zhao)一次用量分裝，并將(jiang)其(qi)貯存(cun)在-20～-80℃冰(bing)箱，具體如下(xia)圖。

4. 生物素化抗體工作液：預先計(ji)算(suan)好試驗(yan)所需用量，用檢測稀釋液（SR2）將100倍抗體濃(nong)縮液稀釋成1倍

應用工作液（稀釋(shi)前充分(fen)混勻），請在(zai)30分(fen)鐘內加入到(dao)反應孔中。

5. 酶(mei)結合物(wu)工作液(ye)(ye)：按每次試驗所需用(yong)量配制，用(yong)酶(mei)結合物(wu)稀(xi)(xi)釋液(ye)(ye)（SR3）將(jiang)100倍濃縮酶(mei)結合物(wu)稀(xi)(xi)釋成1 倍應用(yong)工作液(ye)(ye)（稀(xi)(xi)釋前離心），請在30分鐘內使用(yong)。

6. 洗滌方法： 

自動(dong)洗(xi)板(ban)：甩盡酶標板(ban)孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，注入洗(xi)滌液為 300ul/孔,注 與吸出間隔為 30 秒，洗(xi)板(ban) 5 次。 

手工洗板(ban)(ban)：甩(shuai)盡酶標板(ban)(ban)孔中(zhong)液體，在厚迭(die)吸(xi)水紙上(shang)拍干(gan)，用洗瓶加入洗滌液 300ul/孔，靜止(zhi) 30 秒后甩(shuai) 凈酶標板(ban)(ban)孔中(zhong)液體，在厚迭(die)的吸(xi)水紙上(shang)拍干(gan)，洗板(ban)(ban) 5 次。

結果判斷：

1.用(yong)酶標儀 450 nm 波(bo)(bo)長(chang)測(ce)定 OD 值(zhi)。選(xuan)擇雙(shuang)波(bo)(bo)長(chang)檢測(ce)，參考波(bo)(bo)長(chang)為 630 nm。如不能進行雙(shuang)波(bo)(bo)長(chang)檢測(ce)，請(qing) 用(yong) 450 nm 的 OD 測(ce)定值(zhi)減去 630 nm 的 OD 測(ce)定值(zhi)。

2.計算標準品(pin)、樣(yang)品(pin)的平均(jun) OD 值(zhi)：每(mei)個標準品(pin)和標本的 OD 值(zhi)應減去零孔的 OD 值(zhi)

3.以標(biao)準(zhun)品(pin)濃度(du)為橫坐標(biao)，吸光度(du)OD值為縱坐標(biao)，用軟件繪制標(biao)準(zhun)曲(qu)(qu)線，樣品(pin)中IL-6含量(liang)可通過對(dui)應(ying)OD 值由標(biao)準(zhun)曲(qu)(qu)線換算出相(xiang)應(ying)的濃度(du)。

4.若標本 OD 值(zhi)高于標準曲線(xian)上限，應做適當稀(xi)釋后(hou)重新檢測，計算濃度時(shi)再乘以稀(xi)釋倍數(shu)。

1. 數據及標準曲線

本圖僅供參考，應以當次試驗標準品繪制的標準曲線計算人 IL-6 的樣本含量

 

2. 靈敏度：
低可檢測人 IL-6 濃度達 4pg/ml，
20 個零標準品濃度(du)(du) OD 的(de)(de)平均值加上兩個標準差，計算(suan)相應的(de)(de)可(ke)檢(jian)測濃度(du)(du)。

3. 特異性：
不與(yu)人(ren) IL-6 sR、IL-9、IL-10 反應，小(xiao)鼠 IL-6、IL-10、IL-11、IL-12 等(deng)反應。

4. 重復性：
板(ban)內，板(ban)間變異(yi)系數<10%。

5. 回收率：
在選取的健康(kang)人血漿(jiang)、細胞培養上清中加入 3 個(ge)不同(tong)濃度水平的人 IL-6，計算(suan)回收(shou)率。

6. 線性稀釋：

分別在選取(qu)的 4 份健康(kang)人(ren)血(xue)漿(jiang)和細胞培養(yang)上清中加入高濃度(du)人(ren) IL-6，在標準曲線動力(li)學范(fan)圍內(nei)進行(xing)稀(xi) 釋，評(ping)估線性(xing)。

 

參考文獻：
《iTRAQ‐Based Proteomic Analysis Exploring the Influence of Hypoxia on the Proteome of Dental Pulp Stem Cells under 3D Culture》 作者:Lei Dou  Qifang Yan  Panpan Liang  Pengfei Zhou  Yan Zhang  Ping Ji 期刊:Proteomics 影響因子:3.106 PMID:29327447
《Some cardiac marker levels and cytokines in diabetic patients》 作者:Esmail S. Kakey and Shahen S. Hussen 期刊:International Conference on Pure and Applied Sciences 影響因子: PMID:
《Effect of blood purification on serum miR-126 and VEGF levels in the process of atherosclerosis in uremic patients under maintenance hemodialysis》 作者:Dong Zhao,Hong Shao 期刊:The Kaohsiung Journal of Medical Sciences 影響因子:1.291 PMID:30041762
《Release of mitochondrial DNA correlates with peak inflammatory cytokines in patients with acute myocardial infarction.》 作者:Chaoyi Qin, Jun Gu, Ruiqi Liu, Fei Xu , Hong Qian, Qian He, Wei Meng 期刊(kan):Anatol J Cardiol 影響因子:1.112 PMID:27721319

Human IL-6 ELISA試劑盒