文獻背景
膿毒癥是一種多因素疾病，常繼發于感染，可導致多器官功能障礙。妊娠引起的生理變化使個體容易出現膿毒癥，并帶來更高的死亡風險。然而，造成死亡率增加的機制尚不清楚，針對懷孕膿毒癥患者缺乏適當的治療方法。因此，確定膿毒癥患者全身免疫紊亂的機制是揭示改善產婦和新生兒健康的潛在治療方法。腸道菌群由數萬億細菌組成，能調節感染引起的多器官衰竭的易感性。腸(chang)(chang)道(dao)菌(jun)群調(diao)節疾(ji)病病理的(de)(de)(de)主要機制包括(kuo)：(1)腸(chang)(chang)道(dao)上皮屏障破壞引起(qi)的(de)(de)(de)腸(chang)(chang)漏(lou)的(de)(de)(de)發生(sheng)，(2)腸(chang)(chang)道(dao)內細(xi)菌(jun)代(dai)謝產(chan)物或外膜囊泡的(de)(de)(de)分(fen)泌，(3)腸(chang)(chang)道(dao)菌(jun)群代(dai)謝物耗竭還原(yuan)型谷胱(guang)甘肽(tai)，從而介(jie)導對乙酰氨基酚誘(you)導的(de)(de)(de)肝毒性的(de)(de)(de)晝夜變化。此外，腸(chang)(chang)道(dao)細(xi)菌(jun)來(lai)源(yuan)的(de)(de)(de)格拉司瓊通過(guo)重新編(bian)程巨(ju)噬細(xi)胞因子反應來(lai)保護膿(nong)毒癥誘(you)導的(de)(de)(de)肝損傷。懷(huai)孕改變了腸(chang)(chang)道(dao)微生(sheng)物菌(jun)群的(de)(de)(de)組成，使宿(su)主容易出(chu)現(xian)代(dai)謝綜合征。因此，作者假設產(chan)婦膿(nong)毒癥的(de)(de)(de)高死亡率(lv)與腸(chang)(chang)道(dao)微生(sheng)物菌(jun)群失調(diao)有關。
異質核糖核蛋白U-like protein 2（hnRNPUL2）作為一種RNA結合蛋白可以穩定長非編碼RNA結直腸腫瘤的差異表達（CRNDE），并激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，以促進結腸癌的發生。本研究中，作者想要研究腸道微生物菌群失調在膿毒桿菌宿主免疫功能障礙中的作用。利用細菌中的同源重組，作者證明在懷孕期間微生物釋放刺芒柄花素(FMN)減少。妊娠引起的腸道菌群紊亂增加了膿毒癥的易感性，這是由于細胞核中hnRNPUL2的積累導致巨噬細胞凋亡，這為限制膿毒癥嚴重程度的潛在療法提供了線索。
基本信息
摘要
膿毒癥(zheng)系(xi)指宿(su)主對病原體(ti)感染的(de)免(mian)疫反應失調引起(qi)危及(ji)生命的(de)全身炎癥(zheng)反應綜合征，是(shi)妊娠期女性患(huan)者(zhe)入(ru)院產(chan)科ICU的(de)主要病因，常(chang)常(chang)導(dao)致(zhi)新(xin)生兒發育畸形(xing)、早產(chan)以(yi)及(ji)流產(chan)等(deng)嚴重后果，也是(shi)全球孕(yun)產(chan)婦(fu)死亡的(de)主要原因。
研究人員利用多組(zu)學測(ce)序和同源重組(zu)技術對妊娠(shen)期女(nv)性(xing)和小鼠腸(chang)道(dao)細(xi)菌研究發(fa)現，糞副擬(ni)桿菌(Pmerdae)及(ji)其衍生代(dai)謝物刺芒柄(bing)花素(FMN)的(de)(de)(de)含量(liang)降低，由此(ci)導(dao)致妊娠(shen)期宿主(zhu)的(de)(de)(de)巨(ju)噬細(xi)胞大(da)量(liang)死亡、機體免疫(yi)力下降，從(cong)而增加了妊娠(shen)期宿主(zhu)對膿毒(du)癥的(de)(de)(de)易感性(xing)。FMN屬于常見的(de)(de)(de)中藥單體，具有益氣養陰(yin)的(de)(de)(de)功效。本研究發(fa)現FMN能夠抑制膿毒(du)癥宿主(zhu)的(de)(de)(de)大(da)量(liang)腹(fu)腔巨(ju)噬細(xi)胞發(fa)生焦亡，增加腹(fu)腔巨(ju)噬細(xi)胞數量(liang)以殺(sha)滅(mie)入(ru)侵的(de)(de)(de)病原(yuan)體，從(cong)而降低膿毒(du)癥的(de)(de)(de)死亡率。
此外，該團(tuan)隊通過蛋白質組(zu)學和表(biao)(biao)面等離子體共(gong)振技術成功(gong)鑒定(ding)巨噬(shi)細胞內(nei)異質核糖核蛋白UL2(hnRNPUL2)作為FMN的負(fu)向(xiang)調控蛋白受(shou)體，在膿毒癥期間由胞內(nei)移位至胞核并結合Nlrp3基因(yin)啟(qi)動子區域(yu)，啟(qi)動焦(jiao)亡相關基因(yin)表(biao)(biao)達，引起巨噬(shi)細胞焦(jiao)亡，而(er)敲低(di)hnRNPUL2表(biao)(biao)達，能夠防(fang)止膿毒癥小鼠的多器官功(gong)能衰竭并降低(di)死(si)亡率。臨(lin)床研究(jiu)也發現(xian)，膿毒癥患者(zhe)(zhe)糞便P.merdae和FMN含(han)量與患者(zhe)(zhe)疾病進展呈(cheng)現(xian)出負(fu)相關。
該研究(jiu)揭示(shi)了孕產(chan)婦體內(nei)“P.merdae-FMN-hnRNPUL2"的微生物免疫軸(zhou)在膿毒癥(zheng)期(qi)間的重要生物學意義，為開發妊娠期(qi)膿毒癥(zheng)所(suo)致(zhi)的免疫紊(wen)亂的精準(zhun)治療方案提供了新的策(ce)略。
研究內容及結果
1.妊娠加重了膿毒癥
比(bi)較妊(ren)娠(shen)(shen)小鼠(shu)(shu)(shu)(shu)（P）和(he)(he)未妊(ren)娠(shen)(shen)小鼠(shu)(shu)(shu)(shu)（NP）在盲(mang)腸結扎和(he)(he)穿刺（CLP）后36小時的(de)(de)(de)(de)(de)總(zong)死(si)亡率。與(yu)NP組(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)相比(bi)，P組(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)CLP后死(si)亡率顯著升高(gao)(gao)（圖(tu)1A）。同樣的(de)(de)(de)(de)(de)結果也出現在脂(zhi)多(duo)(duo)糖(tang)刺激小鼠(shu)(shu)(shu)(shu)組(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)，CLP后，P組(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)小鼠(shu)(shu)(shu)(shu)的(de)(de)(de)(de)(de)血漿丙氨酸轉氨酶(mei)（ALT）、肌酐（Cr）濃(nong)度以(yi)及支(zhi)氣(qi)管肺泡灌(guan)洗(xi)液(ye)(ye)（BALF）中的(de)(de)(de)(de)(de)總(zong)蛋白含量(liang)(liang)高(gao)(gao)于NP小鼠(shu)(shu)(shu)(shu)（圖(tu)1B）。組(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)織病理學檢查顯示，與(yu)NP小鼠(shu)(shu)(shu)(shu)相比(bi)，P小鼠(shu)(shu)(shu)(shu)出現了(le)更嚴重的(de)(de)(de)(de)(de)多(duo)(duo)器官損(sun)傷（圖(tu)1C和(he)(he)1D）和(he)(he)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)死(si)亡（圖(tu)1E和(he)(he)1F）。作者量(liang)(liang)化(hua)了(le)P組(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)CLP小鼠(shu)(shu)(shu)(shu)血漿和(he)(he)腹腔灌(guan)洗(xi)液(ye)(ye)（PLF）中TNF-α、IL-1β和(he)(he)IL-6的(de)(de)(de)(de)(de)濃(nong)度，發現大多(duo)(duo)數(shu)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)因子在P組(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)CLP小鼠(shu)(shu)(shu)(shu)中升高(gao)(gao)（圖(tu)1G和(he)(he)1H）。通(tong)過qRT-PCR比(bi)較PLF和(he)(he)BALF細(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)因子和(he)(he)趨(qu)化(hua)因子，發現CLP后P小鼠(shu)(shu)(shu)(shu)的(de)(de)(de)(de)(de)TNF-α、IL-1β、Il-6、Ccl2、Ccl3和(he)(he)Cxcl2 mRNA轉錄量(liang)(liang)高(gao)(gao)于NP小鼠(shu)(shu)(shu)(shu)。妊(ren)娠(shen)(shen)增(zeng)強了(le)CLP誘導的(de)(de)(de)(de)(de)不(bu)同組(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)織的(de)(de)(de)(de)(de)局(ju)部(bu)炎癥(zheng)反(fan)應，從(cong)而增(zeng)加(jia)了(le)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)因子和(he)(he)趨(qu)化(hua)因子的(de)(de)(de)(de)(de)mRNA（圖(tu)S1C）。雖然P和(he)(he)NP小鼠(shu)(shu)(shu)(shu)的(de)(de)(de)(de)(de)糞便總(zong)菌量(liang)(liang)沒(mei)有統計學差異(圖(tu)S1D)，但P組(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)CLP小鼠(shu)(shu)(shu)(shu)的(de)(de)(de)(de)(de)血液(ye)(ye)和(he)(he)PLF中的(de)(de)(de)(de)(de)活(huo)細(xi)菌增(zeng)加(jia)（圖(tu)1I）。16S分析(xi)結果與(yu)P組(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)CLP小鼠(shu)(shu)(shu)(shu)血液(ye)(ye)和(he)(he)PLF的(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)菌培(pei)養結果一致(圖(tu)S1E)。P小鼠(shu)(shu)(shu)(shu)對銅綠假單胞(bao)(bao)(bao)菌（P. aeruginosa）引(yin)起的(de)(de)(de)(de)(de)肺炎也表現出更強的(de)(de)(de)(de)(de)易(yi)感(gan)性(xing)，表現為生(sheng)存期縮短，肺損(sun)傷加(jia)重，以(yi)及強烈的(de)(de)(de)(de)(de)局(ju)部(bu)和(he)(he)全身炎癥(zheng)（圖(tu)1J和(he)(he)S1F-S1J）。妊(ren)娠(shen)(shen)通(tong)過加(jia)重炎癥(zheng)反(fan)應和(he)(he)抑制病原體清(qing)除(chu)能力，增(zeng)加(jia)了(le)膿毒癥(zheng)誘導的(de)(de)(de)(de)(de)多(duo)(duo)器官衰竭(jie)的(de)(de)(de)(de)(de)易(yi)感(gan)性(xing)。
圖1
2.膿毒癥死亡率的增加與腸道菌群有關
作者(zhe)(zhe)為了(le)排除腸(chang)道感(gan)染源的(de)(de)(de)(de)改變可(ke)能直接(jie)(jie)導致妊娠(shen)期(qi)(qi)(qi)CLP誘導的(de)(de)(de)(de)膿(nong)(nong)(nong)毒(du)(du)癥(zheng)(zheng)(zheng)易感(gan)性(xing)增(zeng)加(jia)的(de)(de)(de)(de)可(ke)能性(xing)，從NP和P小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)鼠中分離(li)了(le)盲(mang)腸(chang)細(xi)菌。分別腹腔注射來自NP和P小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)鼠的(de)(de)(de)(de)盲(mang)腸(chang)細(xi)菌混(hun)合物(wu)（CBMs）誘導的(de)(de)(de)(de)兩組(zu)膿(nong)(nong)(nong)毒(du)(du)癥(zheng)(zheng)(zheng)小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)鼠均表(biao)現出相似(si)的(de)(de)(de)(de)易感(gan)性(xing)（圖(tu)2A，S2A和S2B）。通過給廣(guang)譜(pu)抗生(sheng)(sheng)素（ABX）預處理(li)(li)3天耗(hao)盡腸(chang)道微(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)群(qun)(qun)，然后對(dui)小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)鼠進行CLP或(huo)LPS處理(li)(li)，給藥(yao)ABX的(de)(de)(de)(de)腸(chang)道菌群(qun)(qun)缺失在NP和P小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)鼠間(jian)沒有引(yin)發(fa)任(ren)何病理(li)(li)變化（圖(tu)2C），在生(sheng)(sheng)存曲線(xian)統計(ji)學上(shang)無明顯差異(yi)（圖(tu)2B和2C）。作者(zhe)(zhe)對(dui)懷孕(yun)個(ge)(ge)體進行了(le)糞(fen)(fen)便(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)菌群(qun)(qun)移植（FMT）。接(jie)(jie)受(shou)NP供(gong)者(zhe)(zhe)糞(fen)(fen)便(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)的(de)(de)(de)(de)NP小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)鼠比接(jie)(jie)受(shou)P供(gong)者(zhe)(zhe)糞(fen)(fen)便(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)的(de)(de)(de)(de)NP小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)鼠對(dui)膿(nong)(nong)(nong)毒(du)(du)癥(zheng)(zheng)(zheng)的(de)(de)(de)(de)抵(di)抗力更強（圖(tu)2D-2F）。此外，接(jie)(jie)受(shou)P供(gong)體糞(fen)(fen)便(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)的(de)(de)(de)(de)NP小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)鼠在膿(nong)(nong)(nong)毒(du)(du)癥(zheng)(zheng)(zheng)期(qi)(qi)(qi)間(jian)具有更高的(de)(de)(de)(de)血(xue)清ALT活性(xing)和BALF總(zong)蛋(dan)白含(han)量（圖(tu)2G）。在膿(nong)(nong)(nong)毒(du)(du)癥(zheng)(zheng)(zheng)反(fan)應中，接(jie)(jie)受(shou)懷孕(yun)供(gong)者(zhe)(zhe)糞(fen)(fen)便(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)的(de)(de)(de)(de)NP小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)鼠比接(jie)(jie)受(shou)NP供(gong)者(zhe)(zhe)糞(fen)(fen)便(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)的(de)(de)(de)(de)NP小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)鼠發(fa)生(sheng)(sheng)更嚴重的(de)(de)(de)(de)器官損(sun)傷(shang)。此外，在CLP后6小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)時，接(jie)(jie)受(shou)P供(gong)者(zhe)(zhe)糞(fen)(fen)便(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)的(de)(de)(de)(de)NP小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)鼠的(de)(de)(de)(de)血(xue)漿細(xi)胞因(yin)子濃度高于接(jie)(jie)受(shou)NP供(gong)者(zhe)(zhe)糞(fen)(fen)便(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)的(de)(de)(de)(de)NP小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)鼠（圖(tu)2H）。P組(zu)糞(fen)(fen)便(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)微(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)群(qun)(qun)的(de)(de)(de)(de)移植也(ye)加(jia)速了(le)銅綠假單胞菌感(gan)染引(yin)起的(de)(de)(de)(de)膿(nong)(nong)(nong)毒(du)(du)癥(zheng)(zheng)(zheng)小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)鼠的(de)(de)(de)(de)死亡(wang)。相反(fan)，與接(jie)(jie)受(shou)P個(ge)(ge)體糞(fen)(fen)便(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)的(de)(de)(de)(de)P小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)鼠相比，NP個(ge)(ge)體的(de)(de)(de)(de)糞(fen)(fen)便(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)移植降低了(le)膿(nong)(nong)(nong)毒(du)(du)癥(zheng)(zheng)(zheng)的(de)(de)(de)(de)高死亡(wang)率。總(zong)的(de)(de)(de)(de)來說，懷孕(yun)期(qi)(qi)(qi)間(jian)微(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)組(zu)的(de)(de)(de)(de)變化足(zu)以導致膿(nong)(nong)(nong)毒(du)(du)癥(zheng)(zheng)(zheng)的(de)(de)(de)(de)增(zeng)加(jia)。
圖2
3.妊娠期間糞副擬桿菌和FMN豐度降低
16S rRNA基因測序顯(xian)(xian)示，腸道微生物(wu)群(qun)(qun)存在(zai)(zai)明顯(xian)(xian)的組間分(fen)(fen)(fen)離（圖(tu)(tu)3A和(he)3B）。此外，懷孕引起(qi)了腸道微生物(wu)群(qun)(qun)組成的變(bian)化。線性(xing)判別分(fen)(fen)(fen)析（LDA）表(biao)明，懷孕女性(xing)和(he)小鼠(shu)共性(xing)只有糞副擬桿菌呈下降(jiang)趨勢（圖(tu)(tu)3C和(he)3D）。主成分(fen)(fen)(fen)分(fen)(fen)(fen)析（PCA）顯(xian)(xian)示P小鼠(shu)腸道菌群(qun)(qun)代謝譜發生了顯(xian)(xian)著(zhu)變(bian)化（圖(tu)(tu)3E）。火山圖(tu)(tu)和(he)熱圖(tu)(tu)分(fen)(fen)(fen)析顯(xian)(xian)示，強效抗(kang)炎(yan)劑FMN在(zai)(zai)P小鼠(shu)中的水平較(jiao)低(di)（圖(tu)(tu)3F和(he)S4E），靶向(xiang)液相(xiang)色譜—串聯質譜分(fen)(fen)(fen)析進一步證實了這一點（圖(tu)(tu)3G）。與(yu)NP組相(xiang)比，P組女性(xing)的FMN較(jiao)少（圖(tu)(tu)3H）。
4.來自糞副擬桿菌的β-D-半乳糖苷酶是腸道中FMN的關鍵貢獻者
用ABX處(chu)理(li)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)小(xiao)鼠(shu)(shu)(shu)(shu)中(zhong)(zhong)觀察到(dao)FMN濃(nong)度(du)(du)(du)降(jiang)低(di)，這(zhe)表(biao)明(ming)(ming)FMN的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)產(chan)生(sheng)依賴(lai)于(yu)腸道微生(sheng)物(wu)群（圖(tu)(tu)S4F）。通過(guo)綜合(he)多組學分析，證實了(le)樣本中(zhong)(zhong)糞(fen)(fen)副(fu)(fu)(fu)(fu)擬(ni)桿(gan)菌(jun)(jun)(jun)豐度(du)(du)(du)與FMN豐度(du)(du)(du)之間的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)相(xiang)關性（圖(tu)(tu)3I）。此(ci)外，P組糞(fen)(fen)副(fu)(fu)(fu)(fu)擬(ni)桿(gan)菌(jun)(jun)(jun)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)豐度(du)(du)(du)在(zai)懷(huai)孕的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)人和(he)(he)(he)小(xiao)鼠(shu)(shu)(shu)(shu)中(zhong)(zhong)都有(you)所下(xia)降(jiang)，而(er)其他物(wu)種的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)豐度(du)(du)(du)沒(mei)有(you)下(xia)降(jiang)（圖(tu)(tu)3J，3K，S4G和(he)(he)(he)S4H）。在(zai)CLP小(xiao)鼠(shu)(shu)(shu)(shu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)PLF中(zhong)(zhong)，糞(fen)(fen)副(fu)(fu)(fu)(fu)擬(ni)桿(gan)菌(jun)(jun)(jun)豐度(du)(du)(du)降(jiang)低(di)。為了(le)進一(yi)步(bu)闡明(ming)(ming)FMN的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)產(chan)生(sheng)機(ji)制，將P組糞(fen)(fen)副(fu)(fu)(fu)(fu)擬(ni)桿(gan)菌(jun)(jun)(jun)進行了(le)全基(ji)因(yin)組測序，發現該菌(jun)(jun)(jun)株(zhu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)因(yin)組包含13個ORF編碼(ma)不(bu)同β-半乳(ru)糖(tang)(tang)苷酶(mei)家族成(cheng)員(yuan)（圖(tu)(tu)S4K）。β-D-半乳(ru)糖(tang)(tang)苷酶(mei)能以鈣(gai)依賴(lai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)方式促進小(xiao)鼠(shu)(shu)(shu)(shu)FMN的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)釋(shi)放(fang)（圖(tu)(tu)3L）。NP和(he)(he)(he)P小(xiao)鼠(shu)(shu)(shu)(shu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)食物(wu)攝(she)取量相(xiang)似(si)，FMN的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)差異(yi)主要來(lai)自于(yu)腸道中(zhong)(zhong)糞(fen)(fen)副(fu)(fu)(fu)(fu)擬(ni)桿(gan)菌(jun)(jun)(jun)數量。在(zai)糞(fen)(fen)副(fu)(fu)(fu)(fu)擬(ni)桿(gan)菌(jun)(jun)(jun)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)因(yin)組中(zhong)(zhong)存(cun)在(zai)4個編碼(ma)β-D-半乳(ru)糖(tang)(tang)苷酶(mei)成(cheng)員(yuan)；然而(er)，只有(you)ORF01166具有(you)典型的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)N端信號(hao)肽，用于(yu)分泌在(zai)Ser26處(chu)有(you)切割位點（圖(tu)(tu)3M、3N和(he)(he)(he)S4N）。利用同源(yuan)重組技(ji)術制備了(le)P組糞(fen)(fen)副(fu)(fu)(fu)(fu)擬(ni)桿(gan)菌(jun)(jun)(jun)菌(jun)(jun)(jun)株(zhu)ORF01166缺(que)陷(xian)突變(bian)體（圖(tu)(tu)S4O）。缺(que)失該基(ji)因(yin)可阻(zu)斷β-半乳(ru)糖(tang)(tang)苷酶(mei)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)分泌和(he)(he)(he)FMN的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)產(chan)生(sheng)（圖(tu)(tu)3O-3Q）。野生(sheng)型糞(fen)(fen)副(fu)(fu)(fu)(fu)擬(ni)桿(gan)菌(jun)(jun)(jun)預處(chu)理(li)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)膿(nong)(nong)毒癥小(xiao)鼠(shu)(shu)(shu)(shu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)FMN濃(nong)度(du)(du)(du)升高，而(er)β-D-半乳(ru)糖(tang)(tang)苷酶(mei)缺(que)陷(xian)突變(bian)株(zhu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)FMN濃(nong)度(du)(du)(du)沒(mei)有(you)升高（圖(tu)(tu)4A）。隨著糞(fen)(fen)副(fu)(fu)(fu)(fu)擬(ni)桿(gan)菌(jun)(jun)(jun)減少，妊娠(shen)導致膿(nong)(nong)毒癥小(xiao)鼠(shu)(shu)(shu)(shu)PLF中(zhong)(zhong)FMN濃(nong)度(du)(du)(du)降(jiang)低(di)，表(biao)明(ming)(ming)P組糞(fen)(fen)副(fu)(fu)(fu)(fu)擬(ni)桿(gan)菌(jun)(jun)(jun)通過(guo)妊娠(shen)期(qi)間FMN的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)減少參(can)與膿(nong)(nong)毒癥的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)進展。
圖3
5.糞副擬桿菌或FMN治療可減輕P和NP小鼠的膿毒癥的相關炎癥
ELISA檢測發現經糞副擬桿菌(jun)(jun)灌胃預(yu)處(chu)理(li)的(de)NP組CLP小(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)(shu)血漿和(he)(he)PLF中(zhong)TNF-α、IL-1β和(he)(he)IL-6均(jun)降(jiang)(jiang)低(di)（圖(tu)(tu)4B和(he)(he)S5A）。同樣，糞副擬桿菌(jun)(jun)預(yu)處(chu)理(li)分別提(ti)高了(le)(le)(le)NP內(nei)毒(du)(du)素小(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)(shu)和(he)(he)P組CLP小(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)(shu)的(de)存活率（圖(tu)(tu)4C和(he)(he)S5B）。FMN單(dan)獨(du)處(chu)理(li)不會對(dui)NP小(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)(shu)產生毒(du)(du)性。FMN抑(yi)制了(le)(le)(le)血漿ALT、天冬氨酸轉氨酶(mei)（AST）、Cr濃(nong)度(du)和(he)(he)髓過氧化(hua)物酶(mei)（MPO）活性，并提(ti)高了(le)(le)(le)CLP小(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)(shu)的(de)存活率（圖(tu)(tu)4D和(he)(he)4E）。FMN減少(shao)了(le)(le)(le)CLP小(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)(shu)肝、腎和(he)(he)肺的(de)病(bing)變(bian)和(he)(he)細胞死亡（圖(tu)(tu)4F-4I）。FMN降(jiang)(jiang)低(di)了(le)(le)(le)CLP小(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)(shu)肺中(zhong)CD11b+細胞的(de)浸潤，這與血清(qing)中(zhong)TNF-α、IL-1β、IL-6濃(nong)度(du)的(de)降(jiang)(jiang)低(di)一(yi)致。FMN降(jiang)(jiang)低(di)了(le)(le)(le)CLP小(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)(shu)PLF和(he)(he)血液中(zhong)的(de)細菌(jun)(jun)數(shu)量（圖(tu)(tu)4J）。與FMN處(chu)理(li)小(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)(shu)相比，對(dui)照組小(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)(shu)在(zai)LPS處(chu)理(li)后(hou)出現更嚴重的(de)膿毒(du)(du)癥。糞副擬桿菌(jun)(jun)中(zhong)β-D-半(ban)乳糖苷酶(mei)基因缺失破(po)壞了(le)(le)(le)其對(dui)CLP小(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)(shu)MOF的(de)預(yu)防作(zuo)用(yong)（圖(tu)(tu)4K）。綜上所述(shu)，數(shu)據表明(ming)糞副擬桿菌(jun)(jun)或FMN對(dui)膿毒(du)(du)癥小(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)(shu)具有(you)保(bao)護作(zuo)用(yong)。
圖4
6.腸道菌群失調與妊娠期膿毒癥免疫功能障礙有關
經(jing)CLP或LPS處(chu)理(li)的P小(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)PLF中(zhong)(zhong)巨噬細胞(bao)(bao)(bao)和(he)(he)(he)中(zhong)(zhong)性(xing)粒(li)細胞(bao)(bao)(bao)數量減少（圖5A和(he)(he)(he)S6A）。經(jing)ABX預(yu)處(chu)理(li)后，P型(xing)和(he)(he)(he)NP型(xing)膿毒(du)癥小(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)PLF中(zhong)(zhong)巨噬細胞(bao)(bao)(bao)和(he)(he)(he)中(zhong)(zhong)性(xing)粒(li)細胞(bao)(bao)(bao)數量相似(si)（圖5B和(he)(he)(he)S6B）。此外，與接(jie)受NP供者糞(fen)便(bian)的小(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)相比(bi)，預(yu)先給(gei)予P供者糞(fen)便(bian)的膿毒(du)癥小(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)PLF中(zhong)(zhong)的巨噬細胞(bao)(bao)(bao)和(he)(he)(he)中(zhong)(zhong)性(xing)粒(li)細胞(bao)(bao)(bao)數量減少（圖5C，S6C和(he)(he)(he)S6D）。此外，小(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)氣(qi)管(guan)內(nei)感(gan)染銅(tong)綠(lv)假單(dan)胞(bao)(bao)(bao)菌的血液中(zhong)(zhong)單(dan)核(he)細胞(bao)(bao)(bao)和(he)(he)(he)中(zhong)(zhong)性(xing)粒(li)細胞(bao)(bao)(bao)的減少取決于妊娠期間腸(chang)(chang)道微生物群的失調，腸(chang)(chang)道菌群失調會(hui)促進膿毒(du)桿菌小(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)的免疫功能障礙(ai)。
7.FMN可消除膿毒癥小鼠巨噬細胞的減少
巨噬細胞(bao)的耗(hao)竭(jie)不(bu)僅加速了膿毒(du)癥(zheng)(zheng)小鼠(shu)(shu)的死(si)亡，而且降低(di)了FMN誘導(dao)的對膿毒(du)癥(zheng)(zheng)的保護作(zuo)用（圖(tu)5D）。無論給(gei)藥(yao)與(yu)否，巨噬細胞(bao)耗(hao)竭(jie)都(dou)加劇(ju)了膿毒(du)癥(zheng)(zheng)小鼠(shu)(shu)的多器官衰竭(jie)指數（圖(tu)5F和(he)S6N）。無論給(gei)藥(yao)與(yu)否巨噬細胞(bao)耗(hao)竭(jie)損害了細菌清除，導(dao)致CLP小鼠(shu)(shu)血(xue)液中細菌負荷和(he)PLF升高（圖(tu)5H）。正如研(yan)究(jiu)者所(suo)預(yu)期的，糞副擬桿菌和(he)FMN均(jun)能(neng)增加膿毒(du)癥(zheng)(zheng)小鼠(shu)(shu)腹膜(mo)巨噬細胞(bao)的數量（圖(tu)5I和(he)5J）。FMN能(neng)夠通過抑制免疫功能(neng)障礙來促進(jin)細菌清除，從而降低(di)膿毒(du)癥(zheng)(zheng)小鼠(shu)(shu)的死(si)亡率。
圖5
8.FMN抑制膿毒癥中巨噬細胞焦亡
妊娠(shen)增(zeng)(zeng)加了(le)CLP小(xiao)鼠腹(fu)腔(qiang)巨(ju)噬細(xi)(xi)胞的(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞死(si)亡（圖(tu)(tu)6C），在接受P糞(fen)便的(de)(de)(de)膿毒(du)癥小(xiao)鼠中觀察到類似的(de)(de)(de)結果(guo)（圖(tu)(tu)6D）。FMN可降低(di)CLP小(xiao)鼠PLF中巨(ju)噬細(xi)(xi)胞死(si)亡（圖(tu)(tu)6E）。用抑(yi)制(zhi)劑VX765治療(liao)的(de)(de)(de)膿毒(du)癥小(xiao)鼠腹(fu)腔(qiang)巨(ju)噬細(xi)(xi)胞數量增(zeng)(zeng)加(圖(tu)(tu)6F)，而(er)用其他細(xi)(xi)胞死(si)亡抑(yi)制(zhi)劑治療(liao)的(de)(de)(de)小(xiao)鼠腹(fu)腔(qiang)巨(ju)噬細(xi)(xi)胞數量沒(mei)有增(zeng)(zeng)加(圖(tu)(tu)S6P)。轉錄組(zu)分析顯示，FMN改變了(le)LPS + ATP處理的(de)(de)(de)BMDMs的(de)(de)(de)基因表達譜和(he)(he)(he)(he)NOD樣受體信號通路(圖(tu)(tu)S6Q和(he)(he)(he)(he)S6R)。FMN給藥后，BMDMs中含有由LPS和(he)(he)(he)(he)ATP誘導(dao)的(de)(de)(de)CARD (ASC)寡聚的(de)(de)(de)凋亡相關斑(ban)點狀蛋白被抑(yi)制(zhi)（圖(tu)(tu)6K和(he)(he)(he)(he)6L）。VX765極大地抑(yi)制(zhi)了(le)BMDMs的(de)(de)(de)凋亡，而(er)FMN沒(mei)有表現出(chu)額外的(de)(de)(de)抑(yi)制(zhi)作(zuo)用（圖(tu)(tu)S6T和(he)(he)(he)(he)S6U）。FMN除巨(ju)噬細(xi)(xi)胞增(zeng)(zeng)加外，巨(ju)噬細(xi)(xi)胞的(de)(de)(de)吞噬能力也明顯增(zeng)(zeng)強（圖(tu)(tu)S6V和(he)(he)(he)(he)S6W）。
圖6
9.核hnRNPUL2通過結合Nlrp3啟動子誘導巨噬細胞凋亡
蛋白質組學分(fen)析顯(xian)(xian)示，RNA結合蛋白hnRNPUL2是在LPS + ATP處(chu)(chu)理的(de)(de)(de)(de)BMDMs中(zhong)FMN給藥后減(jian)少(shao)最多的(de)(de)(de)(de)蛋白(圖(tu)7A)。使用(yong)RNA干擾技術穩定(ding)地(di)降(jiang)低(di)了hnRNPUL2在BMDMs中(zhong)的(de)(de)(de)(de)表達(da)(圖(tu)S7B)。hnRNPUL2的(de)(de)(de)(de)基因沉默導(dao)致(zhi)ASC寡聚化的(de)(de)(de)(de)抑制和細(xi)胞(bao)死亡(wang)的(de)(de)(de)(de)減(jian)少(shao)(圖(tu)S7C-S7F)。免(mian)疫沉淀分(fen)析顯(xian)(xian)示FMN在體外直接與(yu)hnRNPUL2相互作用(yong)(圖(tu)S7H)。熒光染色(se)顯(xian)(xian)示，FMN增強了hnRNPUL2和溶酶(mei)體在LPS + ATP處(chu)(chu)理的(de)(de)(de)(de)BMDMs中(zhong)的(de)(de)(de)(de)共定(ding)位。hnRNPUL2直接與(yu)BMDMs中(zhong)Nlrp3的(de)(de)(de)(de)啟動子(zi)區結合(圖(tu)S7K)。FMN顯(xian)(xian)著降(jiang)低(di)了LPS + ATP處(chu)(chu)理Raw264.7細(xi)胞(bao)中(zhong)Nlrp3啟動子(zi)的(de)(de)(de)(de)轉(zhuan)錄活性(圖(tu)S7L)。
10.糞副擬桿菌的菌群失調通過FMN-hnRNPUL2-NLRP3軸增強了膿毒癥的易感性
腺相(xiang)(xiang)關病毒(du)(du)沉默了小(xiao)鼠(shu)hnRNPUL2(AAV)介導(dao)的(de)(de)傳遞技術(圖(tu)S7M)。hnRNPUL2的(de)(de)遺傳沉默改善了CLP小(xiao)鼠(shu)的(de)(de)存(cun)活率和(he)減毒(du)(du)MOF(圖(tu)7M、7N和(he)S7N)。糞副擬桿(gan)菌(jun)的(de)(de)豐(feng)度(du)與膿毒(du)(du)癥患(huan)者血(xue)漿降鈣素原(PCT)和(he)Cr濃(nong)度(du)呈負相(xiang)(xiang)關(圖(tu)7O)。同時(shi)，膿毒(du)(du)癥患(huan)者腸道FMN含量與血(xue)清ALT和(he)AST濃(nong)度(du)呈負相(xiang)(xiang)關(圖(tu)7P)。綜上(shang)所(suo)述，揭示了糞副擬桿(gan)菌(jun)的(de)(de)菌(jun)群(qun)失(shi)調在介導(dao)免疫(yi)軸(zhou)FMN-hnRNPUL2-NLRP3中的(de)(de)意義，該軸(zhou)通過誘(you)導(dao)膿毒(du)(du)癥患(huan)者巨噬細胞焦(jiao)亡進而引起(qi)免疫(yi)功(gong)能障礙。
圖7
結論
本實驗中，研究(jiu)人員使用抗生素治療和(he)糞便微(wei)生物轉移，發現在小(xiao)鼠和(he)人類中，膿毒癥(zheng)易感性是由妊娠引(yin)起(qi)的(de)(de)(de)(de)菌群(qun)變化(hua)驅動的(de)(de)(de)(de)。綜(zong)合多組學和(he)細菌基因工(gong)程學研究(jiu)表明(ming)，妊娠期腸(chang)道(dao)糞副擬桿菌(P. merdae)的(de)(de)(de)(de)數量降(jiang)低導(dao)致了(le)FMN的(de)(de)(de)(de)降(jiang)低和(he)巨噬(shi)細胞(bao)(bao)死亡(wang)的(de)(de)(de)(de)增加。從機制(zhi)上講，FMN通(tong)過(guo)抑(yi)制(zhi)hnRNPUL2的(de)(de)(de)(de)積累以及與(yu)NLRP3啟動子的(de)(de)(de)(de)結合來(lai)抑(yi)制(zhi)巨噬(shi)細胞(bao)(bao)焦亡(wang)。用FMN治療或敲(qiao)除小(xiao)鼠hnRNPUL2可防止感染(ran)性炎癥(zheng)。P. merdae和(he)FMN的(de)(de)(de)(de)腸(chang)道(dao)含量與(yu)膿毒癥(zheng)患者的(de)(de)(de)(de)進(jin)展呈負相(xiang)關(guan)。總之，揭示了(le)在妊娠膿毒癥(zheng)宿主(zhu)中被破壞的(de)(de)(de)(de)微(wei)生物免疫途徑，突出了(le)FMN-hnRNPUL2-NLRP3在膿毒癥(zheng)治療方面的(de)(de)(de)(de)潛力。
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