產品名稱::線粒體呼吸鏈復合體Ⅴ活性檢測試劑盒產品英(ying)文名: Mitochondrial Respiratory Chain ComplexⅤActivity Assay Kit產(chan)品貨(huo)號:BC1440 產地:北京(jing)市通州區馬駒橋聯東U谷(gu)8三(san)樓產品規(gui)格:50管/24樣 產品商標:solarbio 保(bao)存(cun)(cun)與運(yun)輸:4℃保(bao)存(cun)(cun)或-20℃保(bao)存(cun)(cun); 參(can)考價格:2600 庫存狀態:現貨 關(guan)鍵(jian)字(zi):: : : 線粒體(ti)呼吸鏈(lian)復(fu)合體(ti)Ⅴ檢測試劑盒(he)| 線粒體呼(hu)吸鏈復(fu)合體Ⅴ|線粒體呼(hu)吸鏈|試劑盒
簡要介紹: 線粒(li)體(ti)復合(he)體(ti)Ⅴ又稱F1F0-ATP合(he)酶(mei)(mei),廣(guang)泛存在于動物(wu)、植(zhi)物(wu)、微生物(wu)和(he)培養細(xi)胞的(de)線粒(li)體(ti)中(zhong),由F1和(he)F0兩(liang)個亞單位(wei)組成。該酶(mei)(mei)利用呼吸鏈(lian)產(chan)生的(de)質子電化(hua)學(xue)梯度(du)催化(hua)ATP合(he)成,也可逆過(guo)程水解ATP。此外(wai),復合(he)體(ti)Ⅴ還(huan)存在于葉綠(lv)體(ti)、異養菌(jun)和(he)光合(he)細(xi)菌(jun)中(zhong)。復合(he)體(ti)Ⅴ是線粒(li)體(ti)氧化(hua)磷(lin)酸化(hua)和(he)葉綠(lv)體(ti)光合(he)磷(lin)酸化(hua)合(he)成ATP的(de)關鍵酶(mei)(mei)。 復合(he)體(ti)Ⅴ水解ATP 產生ADP 和Pi,通過測(ce)定Pi 增加速率來測(ce)定復合(he)體(ti)Ⅴ活性。
產品詳細(xi)描述(shu) 產品內容(rong): 提取液:液體15mL×1瓶,4℃保存; 試劑(ji)一(yi):液體15mL×1瓶,4℃保存; 試劑二: 粉(fen)劑×1支(zhi),-20℃保存(cun);臨用(yong)前每(mei)支(zhi)加入1.11mL雙蒸(zheng)水(shui),充分溶解備(bei)用(yong),分裝后-20℃保存(cun),避免反復(fu)凍融; 試(shi)劑三(san):液(ye)體(ti)6mL×1瓶,4℃保(bao)存(cun); 試劑四:粉劑×1瓶,4℃保(bao)存;臨用前加(jia)入3mL雙(shuang)蒸水,充分(fen)混勻(yun); 試劑(ji)五:粉劑(ji)×1瓶,4℃保存;臨(lin)用(yong)前加入10mL雙(shuang)蒸水,充分混勻(yun); 試(shi)劑(ji)六:粉劑(ji)×1瓶,4℃保存;臨用前(qian)加入10mL雙蒸水,充分混(hun)勻; 試劑七:液體10mL×1 瓶,室(shi)溫保(bao)存。 標準品:液(ye)體1mL×1 支(zhi),4℃保存。10μmol/mL磷(lin)標準液(ye)。臨用前用蒸餾水稀釋40倍即0.25μmol/mL 磷(lin)標準液(ye)。 定(ding)磷(lin)試(shi)(shi)劑(ji)的配制:按H2O:試(shi)(shi)劑(ji)五:試(shi)(shi)劑(ji)六(liu):試(shi)(shi)劑(ji)七=2:1:1:1 的比例(li)配制,配好的定(ding)磷(lin)試(shi)(shi)劑(ji)應(ying)為淺黃色(se)。若(ruo)無色(se)則試(shi)(shi)劑(ji)失效(xiao),若(ruo)是藍色(se)則為磷(lin)污染(請根據(ju)需要,用多少配多少)。 注(zhu)意:配試(shi)劑用新的燒杯(bei)、玻璃棒和玻璃移(yi)液(ye)器,或者一(yi)次性(xing)塑料器皿,以避免磷(lin)污染。 產(chan)品說明: 線粒體復合體Ⅴ又稱F1F0-ATP合(he)(he)(he)酶(mei),廣泛存(cun)在于動物、植物、微(wei)生物和(he)培養細胞的(de)線粒(li)體中,由F1和(he)F0兩(liang)個亞單(dan)位組成。該酶(mei)利(li)用呼吸鏈產生的(de)質子(zi)電(dian)化(hua)學梯度(du)催化(hua)ATP合(he)(he)(he)成,也可逆(ni)過程(cheng)水(shui)解(jie)ATP。此(ci)外,復(fu)合(he)(he)(he)體Ⅴ還存(cun)在于葉綠(lv)體、異養菌(jun)和(he)光合(he)(he)(he)細菌(jun)中。復(fu)合(he)(he)(he)體Ⅴ是線粒(li)體氧化(hua)磷酸化(hua)和(he)葉綠(lv)體光合(he)(he)(he)磷酸化(hua)合(he)(he)(he)成ATP的(de)關鍵(jian)酶(mei)。 復合體Ⅴ水解ATP產生ADP和Pi,通過測定Pi增(zeng)加速(su)率(lv)來(lai)測定復合體Ⅴ活性。 試驗中(zhong)所需的儀器和(he)試劑: 臺式離(li)心機、可見分光光度計、水浴鍋(guo)、1mL玻璃比(bi)色皿、可調(diao)式移液槍、研(yan)缽/勻(yun)漿器、冰(bing)和(he)蒸餾水。 操作步驟: 一、復合體Ⅴ的提取: - 稱取(qu)約0.1g組(zu)織或收集500萬細胞,加入1.0 mL提(ti)取(qu)液,用冰浴(yu)勻漿器或研缽勻漿。
- 4 ℃ 600 g離心(xin)10min。
- 將上清液移(yi)另(ling)一離(li)心管中,4 ℃ 11000 g離(li)心15min。
- 上清液即胞(bao)漿提取物(wu),可用于(yu)測(ce)定從線粒體泄漏的復合體Ⅳ(此步可選做,可以判(pan)斷(duan)線粒體(ti)提取效果)。
- 在沉淀(dian)中加入400uL提取液,超聲波(bo)破碎(功率20%,超聲5秒(miao),間隔10秒(miao),重復(fu)15次),用于復(fu)合(he)體Ⅳ酶(mei)活性(xing)測定,并且用于蛋白含量測定。
二、測(ce)定步驟: - 可見分光光度計預(yu)熱30min以上,調(diao)節(jie)波(bo)長(chang)660nm,蒸(zheng)餾水(shui)調(diao)零。
- 操(cao)作(zuo)表:
(1)酶(mei)促(cu)反應 試劑(ji)名稱(cheng)(μL) | 對(dui)照管 | 測定(ding)管 | 標(biao)準(zhun)管 | 試(shi)劑(ji)二 | 40 | 40 | - | 試劑三 | 160 | 160 | - | 樣品 | - | 200 | - | 混勻, 37℃(哺乳(ru)動物(wu))或25℃(其它(ta)物(wu)種)準(zhun)確水浴30min | 試(shi)劑四 | 80 | 80 | - | 樣品(pin) | 200 | | - | 混勻,8000rpm,室溫(wen)離心10min,取(qu)上清液(ye) |
(2)定磷(lin) 上清液 | 200 | 200 | 200 | 定(ding)磷試劑 | 1000 | 1000 | 1000 |
混勻,40℃水浴10min,盡快在660nm測(ce)定(ding)吸光值,分別記為A測(ce)定(ding)管、A對(dui)照管、A標(biao)準管,計算ΔA=A測(ce)定(ding)管-A對(dui)照管。
三、復(fu)合體Ⅴ活力單位的計算: 單位(wei)(wei)的定義:每mg組(zu)織蛋白在反應體系(xi)中每分(fen)鐘產生1 nmol 無機磷定義為一個(ge)酶(mei)活性單位(wei)(wei)。 復合(he)體Ⅴ活性(U/mg prot)=ΔA÷A標準(zhun)×C標準(zhun)×V酶促×1000÷(Cpr×V樣品)÷T =20×ΔA÷A標準÷Cpr。 C標準液(ye):標準溶液(ye)濃(nong)(nong)度(du),0.25μmol/mL; 1000:1μmol=1000nmol;Cpr:樣(yang)品(pin)蛋(dan)白濃(nong)(nong)度(du),mg/mL,需自(zi)行測定(ding),推(tui)薦(jian)我(wo)公司BCA蛋(dan)白濃(nong)(nong)度(du)測定(ding)試劑盒;V樣(yang)品(pin):樣(yang)品(pin)體(ti)積,0.2mL;V酶促(cu),酶促(cu)反應總(zong)體(ti)積,0.48mL;T:反應時間(jian),30min。 注(zhu)意事項: - 為保證實驗(yan)結果(guo)的準確性,需(xu)先(xian)取1-2個樣(yang)做預實驗(yan),如果(guo)測定的吸光(guang)值過高(高于1),可用(yong)蒸餾水稀(xi)釋(shi)上清液后再測定。計算結果(guo)時注意乘以(yi)稀(xi)釋(shi)倍數。若(ruo)ΔA大于0.4,需將(jiang)樣(yang)本(ben)稀釋適(shi)當倍數(計算(suan)公(gong)式中乘(cheng)以相(xiang)應(ying)稀釋倍數),使A1-A2 小于0.2,可提高檢測(ce)靈敏度;若(ruo)ΔA偏小,則(ze)可以通過增加(jia)加(jia)入的樣(yang)品體積來提高靈敏度。
- 由(you)于提(ti)取液(ye)中含(han)(han)有蛋白,所以(yi)在測定樣品(pin)蛋白濃度時需要減(jian)去提(ti)取液(ye)本(ben)身(shen)的蛋白含(han)(han)量(單獨測量(liang))。
- 本試劑盒試劑足夠完成(cheng)50管反應(ying)。
- 附:使(shi)用(yong)樣本(ben)重量(liang)計算公式:(檢測樣本(ben)數為(wei)50T/24S)
A、上清(qing)中復合體Ⅳ活力的計算(suan): 按樣本鮮重(zhong)計算: 單位定(ding)義:每(mei)g組織在反應(ying)體系中每(mei)分鐘(zhong)催化降(jiang)解1nmol還原型細胞色素C定(ding)義為一(yi)個酶(mei)活力單位。 復(fu)合體(ti)Ⅳ活(huo)力(U/g)=[ΔA1×V 反總÷(ε×d)×109]÷(W÷V提(ti)取(qu)×V樣)÷T=1099×ΔA1÷W ΔA1:上清測定(ding)值;V 反總:反應體(ti)(ti)系總體(ti)(ti)積,8.4×10-4 L;ε:細(xi)胞色素(su)C摩爾消光系數(shu),1.91×104 L / mol /cm;d:比(bi)色皿光徑,1cm;V 樣(yang):加(jia)入(ru)樣(yang)本體(ti)積,0.04 mL;V提取(qu):加入提取(qu)液體積,1.0mL。 w:樣(yang)本(ben)重量,g。T:反(fan)應時間,1 min; B、沉淀中復合體Ⅳ活力的計算: 按樣本鮮重計算: 單(dan)位定(ding)(ding)義(yi)(yi):每g組織在反(fan)應體(ti)系中每分鐘催化降解1nmol還原型細(xi)胞(bao)色素(su)C定(ding)(ding)義(yi)(yi)為(wei)一個(ge)酶(mei)活力單(dan)位。 復合(he)體(ti)Ⅳ活力(U/g)=[ΔA2×V 反總(zong)÷(ε×d)×109]÷(W÷V提取×V樣)÷T=440×ΔA2÷W ΔA2:沉淀測定值;V 反總(zong):反應體系總(zong)體積,8.4×10-4 L;ε:細(xi)胞色素C摩爾消光系(xi)數,1.91×104 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V 樣(yang)(yang):加入樣(yang)(yang)本體積,0.04 mL;V提(ti)取(qu):加入提(ti)取(qu)液(ye)體積,0.4mL。 w:樣(yang)本重量(liang),g。T:反應時間,1 min; C、樣本復合體(ti)Ⅳ總活力的計(ji)算: 樣本復合體Ⅳ總活力即(ji)為上清(qing)中復合體Ⅳ活力(li)與(yu)沉淀(dian)中復合體Ⅳ活力之和。 按樣本(ben)鮮重計算(suan): 復(fu)合體Ⅳ(U/g)=1099×ΔA1÷W+440×ΔA2÷W
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