丙酮酸脫氫酶(PDH)活性檢測試劑盒 注意:正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定。 貨號: BC0380 規格: 50T/48S 產品內容: 試劑一:液體60mL×1 瓶,4℃保(bao)存; 試劑(ji)二:液體1mL×1 支,-20℃避光保存; 試劑三(san):液體 50mL×1 瓶,4℃保存; 試(shi)劑四:粉劑×1 支,4℃保(bao)存; 試劑五:粉劑×1 支,-20℃保存(cun); 試劑六(liu):粉劑×1 支,4℃保存(cun); 試劑七:粉(fen)劑×1 支,4℃保存; 工作液的配制:臨用前把試劑四、五、六、七轉移到試劑三中混合溶解待用;用不完的試劑 4℃保存一周。 產品說明: PDH(EC 4.1.1.1)廣泛(fan)存在于(yu)動物(wu)、植物(wu)、微生物(wu)和(he)培養細胞中(zhong),是丙酮酸脫氫(qing)酶復合體(ti)(PDHC)催化(hua)丙酮酸氧(yang)化(hua)脫羧的限速酶,催化(hua)丙酮酸脫梭生成(cheng)羥(qian)乙基-TPP,把糖酵解和(he)三羧酸循(xun)環連接起來。PDH催化(hua)丙酮酸脫氫(qing),同時還原2,6-二氯酚靛酚(2,6-DCPIP),從而導致605nm光吸收(shou)的減少。 需自備的儀器和用品: 可(ke)見分光光度計(ji)、水浴鍋(guo)、臺(tai)式(shi)(shi)離心(xin)機、可(ke)調(diao)式(shi)(shi)移液器、1mL 比色皿(min)、研缽(bo)、冰和蒸餾水。 操作步驟: 一、樣本的處理 稱(cheng)取(qu)約 0.1g 組織或(huo)收集(ji) 500 萬細胞,加入1mL 試劑一和 10μL試劑二,用冰浴勻漿器或(huo)研缽勻漿充分研磨,4 ℃ 11000 g離心10min,取(qu)上(shang)清,置冰上(shang)待測。 二、測定步驟 1、分光光度計預熱(re) 30min以上(shang),調節(jie)波(bo)長 605nm,蒸餾(liu)水調零。 2、每個(ge)樣(yang)本需要(yao)900μL工(gong)作液,按樣(yang)本數加一取出一定量的(de)工(gong)作液于37℃(哺乳動物)或25℃(其他(ta)物種)中孵育5min。 3、空白管:在1mL比色皿中加(jia)入900 µL工(gong)作液和50µL水,混勻,立即記錄605nm處初始吸光值A1和1min后的(de)吸光值A2,計算(suan) ΔA空白=A1-A2。 4、測定管(guan):在1mL 比(bi)色皿中(zhong)加(jia)入900 µL工(gong)作液和50µL樣本,混勻(yun),立即記錄 605nm 處(chu)初始(shi)吸光(guang)值(zhi)A3和1min后的吸光(guang)值(zhi)A4,計(ji)算ΔA測定=A3-A4。 三、PDH 活性計算 (1) 按樣本蛋(dan)白濃(nong)度(du)計算(suan) 單(dan)位的定(ding)義:每mg 組織蛋白每分鐘(zhong)消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定(ding)義為一個酶活性單(dan)位。 PDH活性(U /mg prot)=[(ΔA測定-ΔA空白)×V 反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr)÷T =904.762×(ΔA測(ce)定(ding)-ΔA空白)÷Cpr (2) 按(an)樣本(ben)鮮重計算 單位(wei)的定(ding)義:每g組織(zhi)每分鐘消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定(ding)義為一個酶活性單位(wei)。 PDH活性(U/g鮮重)=[(ΔA測定-ΔA空白)×V反總÷(ε×d)×109]÷(W×V樣÷V樣總)÷T =913.81×(ΔA測定(ding)-ΔA空白(bai))÷W (3) 按細菌(jun)或細胞密(mi)度(du)計算 單位的定義(yi):每1萬個細菌(jun)或細胞(bao)每分鐘(zhong)消耗(hao)1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義(yi)為(wei)一個酶活(huo)性(xing)單位。 PDH 活性(U/104 cell)=[(ΔA測定-ΔA空白)×V 反總÷(ε×d)×109]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=1.828×(ΔA測(ce)定-ΔA空白) V 反總:反應體系總體積,9.5×10-4 L;ε:2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數,2.1×104 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V 樣:加入樣本體積,0.05 mL;V 樣總:加入試劑一和試劑二體積,1.01 mL;T:反應時間,1 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;500:細菌或細胞總數,500 萬。 注意事項: 1、測定過程中所有樣本在(zai)冰上放置,以免變性和失活(huo)。 2、測定(ding)管的(de)ΔA值在(zai)0.01-0.25之(zhi)間,若測定(ding)管的(de)ΔA值大于0.25,需將樣本進行(xing)稀釋。 丙酮酸脫氫酶(PDH)活性檢測試劑盒 |