生化法 輔酶ⅠNAD(H)含量檢測試劑盒 產品(pin)名稱:輔酶(mei)ⅠNAD(H)含(han)量檢測試劑盒 微量法產(chan)品(pin)英文(wen)名: Micro NAD(H) Kit產品貨號:BC0315 產地:北(bei)京市通州區馬(ma)駒(ju)橋聯東(dong)U谷8三樓產(chan)品規格:100管/48樣 產品商標:solarbio 保存與運(yun)輸:4℃保存(cun)或-20℃保存; 參考價格:1180 庫存狀(zhuang)態:現貨 關鍵字:輔酶(mei)ⅠNAD(H)試(shi)劑盒|含量檢測試劑盒|輔酶ⅠNAD(H)含量檢測|微(wei)量(liang)法
簡要(yao)介紹: 輔(fu)酶ⅠNAD(H)廣泛(fan)存在于(yu)動物(wu)、植物(wu)、微(wei)生物(wu)和(he)(he)培養(yang)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)中,NAD+是糖(tang)酵解(jie)(jie)(jie)(EMP)和(he)(he)三羧(suo)酸(suan)循(xun)環(huan)(huan)(TCA)的(de)主(zhu)要氫受體,生成(cheng)的(de)NADH經(jing)呼(hu)吸電子(zi)鏈(ETC)傳遞把電子(zi)交給氧,在合成(cheng)ATP的(de)同(tong)時,形(xing)成(cheng)大量(liang)的(de)ROS,同(tong)時NADH再(zai)生為(wei)NAD+。糖(tang)、脂、蛋白質(zhi)三大代(dai)謝物(wu)質(zhi)分解(jie)(jie)(jie)中的(de)氧化反應絕大部(bu)分通過這一體系完成(cheng)。NAD(H)含量(liang)和(he)(he)NADH/NAD+比值(zhi)的(de)高低可用于(yu)評價糖(tang)酵解(jie)(jie)(jie)和(he)(he)TCA循(xun)環(huan)(huan)的(de)強弱。較(jiao)高的(de)NAD(H)及(ji)NADH/NAD+比值(zhi)說(shuo)明細(xi)(xi)胞(bao)(bao)呼(hu)吸耗氧量(liang)較(jiao)高,處(chu)于(yu)過氧化狀態(tai)。此外,NADH/NAD+比值(zhi)升(sheng)高也(ye)可抑制糖(tang)酵解(jie)(jie)(jie)和(he)(he)TCA循(xun)環(huan)(huan)。另外,NAD+降(jiang)解(jie)(jie)(jie)產物(wu)對細(xi)(xi)胞(bao)(bao)信(xin)號傳導、代(dai)謝和(he)(he)基因表達(da)等具有(you)重要的(de)調控作用。
產品詳細(xi)描述 商品貨號: | 商品品牌: | 規格 | 基(ji)本(ben)售(shou)價: | 選擇規格 | BC0315-100管/48樣(yang) | Solarbio | 100管/48樣 | 1180.00元 | |
產(chan)品(pin)內容: 酸性(xing)提取液:25mL×1 瓶,4℃保存; 堿(jian)性提取(qu)液:25mL×1 瓶,4℃保(bao)存; 試劑一:液體 5mL×1 瓶(ping),4℃保存; 試劑二:液(ye)體 1.5mL×1 支(zhi),4℃保存 試劑(ji)三(san):粉劑(ji)×1 支,-20℃保存(cun),用時(shi)加(jia)入 1.6mL 雙蒸水,混勻,4℃保存(cun)一周(zhou); 試(shi)劑(ji)四:粉劑(ji)×1 支,4 ℃保存,用時加入 1.9mL 雙蒸水(shui),混(hun)勻,4℃保存一周; 試劑五:液體(ti) 0.7mL×1 支(zhi),4 ℃保(bao)存; 試(shi)劑六:液體 10mL×1 瓶,4 ℃保存; 試(shi)劑七:自(zi)備。19.2mL 乙醇和 0.8mL 蒸餾水充分(fen)混合備用。 NAD 標(biao)準品:粉劑×1 支(zhi),-20℃保存。臨用(yong)前(qian)加入 1.5mL 蒸餾水(shui),即 2umol/mL,將其稀釋為 1.25nmol/mL 的 NAD 標(biao)準溶(rong)液備(bei)用(yong)。 NADH 標準(zhun)品:粉劑(ji)×1 支(zhi),-20℃保(bao)存。臨(lin)用前加入 1.4mL 蒸餾水(shui),即 2umol/mL,將其稀釋為(wei) 1.25nmol/mL 的 NADH 標準(zhun)溶液備用。 操作步驟: 一、NAD+和 NADH 的提取: 1、血清(漿)中 NAD+和 NADH 的(de)提(ti)取(qu): NAD+的提(ti)取:取 0.1mL 血清(漿),加入(ru) 0.5mL 酸(suan)性提(ti)取液,煮沸(fei) 5min (蓋(gai)緊(jin),以防(fang)止水分 散(san)失),冰浴(yu)冷卻后,10000g 4℃離心 10min;取上(shang)(shang)清 200uL,加入(ru)等體積堿(jian)性提(ti)取液;混勻(yun),10000g 4℃離心 10min,取上(shang)(shang)清,冰上(shang)(shang)保(bao)存待測。 NADH 的(de)提(ti)取(qu)(qu):取(qu)(qu) 0.1mL 血(xue)清(漿),加入 0.5mL 堿性提(ti)取(qu)(qu)液(ye),煮(zhu)沸 5min(蓋緊,以防止水分(fen) 散失),冰(bing)浴冷卻后(hou),10000g 4℃離(li)心 10min,取(qu)(qu)上清 200uL,加入等體積(ji)酸(suan)性提(ti)取(qu)(qu)液(ye);混勻,10000g 4℃離(li)心 10min,取(qu)(qu)上清,冰(bing)上保存待測(ce)。 2、組織中 NAD+和 NADH 的提取(qu): NAD+的提(ti)取(qu)(qu):稱取(qu)(qu)約 0.1g 組織,加(jia)入 0.5mL 酸性提(ti)取(qu)(qu)液(ye),冰浴研磨,煮(zhu)沸 5min(蓋緊,以(yi)防 止水(shui)分散失),冰浴冷卻后,10000g 4℃離心 10min,取(qu)(qu)上清 200uL,加(jia)入等體(ti)積堿性提(ti)取(qu)(qu)液(ye)混勻, 10000g 4℃離心 10min,取(qu)(qu)上清,冰上保存(cun)待測(ce)。 NADH 的提取(qu):稱取(qu)約 0.1g 組織,加入 0.5mL 堿性提取(qu)液,冰(bing)浴研磨,煮(zhu)沸(fei) 5min(蓋緊,以防(fang) 止水(shui)分散(san)失),冰(bing)浴冷卻(que)后,10000g 4℃離心 10min,取(qu)上清 200uL,加入等體積酸性提取(qu)液混勻(yun), 10000g 4℃離心 10min,取(qu)上清,冰(bing)上保(bao)存待測。 3、細胞或細菌(jun)中 NAD+和(he) NADH 的提取(qu): NAD+的提取:收集 500 萬細胞或細菌,加(jia)入 0.5mL 酸性提取液,超聲(sheng)波破碎(sui) 1min(強度(du) 20% 或 200W,超聲(sheng) 2s,停(ting) 1s),煮(zhu)沸 5min(蓋(gai)緊,以防止水分(fen)散失(shi)),冰浴中(zhong)冷卻后,10000g 4 ℃離心(xin)(xin) 10min,取上清液 200uL 另一新(xin)的離心(xin)(xin)管中(zhong),加(jia)入等體積(ji)的堿性提取液使(shi)之中(zhong)和,混勻(yun),10000g 4℃ 離心(xin)(xin) 10min,取上清,冰上保(bao)存待測。 NADH 的提取(qu)(qu):收集 500 萬細(xi)胞或細(xi)菌(jun),加(jia)入(ru) 0.5mL 堿(jian)性提取(qu)(qu)液(ye)(ye),超(chao)聲波破碎 1min(強度(du) 20% 或 200W,超(chao)聲 2s,停 1s),煮沸 5min(蓋(gai)緊(jin),以防(fang)止水分(fen)散(san)失),冰(bing)浴中(zhong)冷卻(que)后,10000g 4 ℃離心 10min,取(qu)(qu)上(shang)清液(ye)(ye) 200uL 另(ling)一(yi)新的離心管(guan)中(zhong),加(jia)入(ru)等體積的酸性提取(qu)(qu)液(ye)(ye)使之中(zhong)和,混勻,10000g 4℃ 離心 10min,取(qu)(qu)上(shang)清,冰(bing)上(shang)保存待測。
二、測定步驟: 1、可(ke)見分(fen)光(guang)光(guang)度計/酶(mei)標儀調節波長570nm,蒸餾水(shui)調零。 2、 操作表(biao)(在1.5ml棕色EP管(guan)中按下表(biao)依次加樣)
試劑名稱 | 對照管(µL) | 測定(ding)管(µL) | NAD 或 NADH 標準(zhun)管 | 空白管 | 上清液 | 10 | 10 | | | 標(biao)準溶液 | | | 10 | | 蒸(zheng)餾(liu)水 | | | | 10 | 試劑六(liu) | 100 | | | | 試劑一 | 50 | 50 | 50 | 50 | 試(shi)劑二 | 15 | 15 | 15 | 15 | 試(shi)劑三 | 15 | 15 | 15 | 15 | 試劑四(si) | 15 | 15 | 15 | 15 | 試劑五 | 7 | 7 | 7 | 7 | 充分混勻,室溫(wen)避光靜置20min | 試劑(ji)六(liu) | | 20 | 20 | 20 | 充分混勻,靜置5min后,15000rpm,25℃離心15min,棄(qi)上清,沉淀中(zhong)加入: | 試(shi)劑七 | 200 | 200 | 200 | 200 |
混勻, 570nm 下比色,讀(du)取吸光(guang)值ΔA 測定(ding)=A 測定(ding)管(guan)(guan)-A 對照(zhao)管(guan)(guan),NAD 標(biao)(biao)準管(guan)(guan)的(de)記為(wei)(wei)ΔA 標(biao)(biao)準 1=A 標(biao)(biao)準管(guan)(guan) 1-A 空(kong)白(bai)管(guan)(guan)。 NADH 標(biao)(biao)準管(guan)(guan)的(de)記為(wei)(wei)ΔA 標(biao)(biao)準 2=A 標(biao)(biao)準管(guan)(guan) 2-A 空(kong)白(bai)管(guan)(guan)。空(kong)白(bai)管(guan)(guan)只需做一 到兩次。
注意事項: 1、操(cao)作過程應避(bi)光(guang)。不可將試劑一、二、三和四混合(he)后再加,必須分開加。 2、反應過程要注意避光(guang)。 3、當吸光(guang)值大于 1 時,建議稀(xi)釋后測量,計算公式(shi)中應當乘(cheng)以稀(xi)釋倍數(shu)。
NAD+含量的(de)計算 - 血清(漿)中 NAD+含(han)量(liang)計算
NAD+含量(nmol/mL)=ΔA 測定÷(ΔA 標準(zhun) 1÷C 標)×V 提(ti)取÷V 血清=12.5×ΔA 測定÷ΔA 標準(zhun) 1 2、組(zu)織、細菌、細胞中(zhong) NAD+含量計(ji)算 (1)按樣本蛋白濃度(du)計算(suan) NAD+ (nmol/mg prot)=ΔA 測定(ding)(ding)÷(ΔA 標(biao)準(zhun)(zhun) 1÷C 標(biao))×V 提取÷(V 提取×Cpr) = 1.25×ΔA 測定(ding)(ding)÷ΔA 標(biao)準(zhun)(zhun) 1 (2)按樣本(ben)鮮重計(ji)算 NAD+ (nmol/g 鮮(xian)重)=ΔA 測(ce)定÷(ΔA 標準(zhun) 1÷C 標)×V 提取÷W= 1.25×ΔA 測(ce)定÷ΔA 標準(zhun) 1÷W (3)按細菌或細胞密度計(ji)算 NAD+ (nmol/10 4cell)=ΔA 測定(ding)÷(ΔA 標準(zhun)(zhun) 1÷C 標)×V 提(ti)取(qu)÷500=0.0025×ΔA 測定(ding)÷ΔA 標準(zhun)(zhun) 1
NADH 含量(liang)的計算 - 血清(漿(jiang))中 NADH 含(han)量(liang)計(ji)算(suan)
NADH 含量(nmol/mL)=ΔA 測(ce)定÷(ΔA 標準(zhun) 2÷C 標)×V 提(ti)取÷V 血清 =12.5×ΔA 測(ce)定÷ΔA 標準(zhun) 2 2、組織中(zhong) NADH 含量計算 (1)按樣本(ben)蛋白濃度計算 NADH (nmol/mg prot)=ΔA 測定÷(ΔA 標準 2÷C 標)×V 提取(qu)÷(V 樣品×Cpr) = 1.25×ΔA 測定÷ΔA 標準 2 (2)按樣本鮮(xian)重計算 NADH (nmol/g 鮮重)=ΔA 測(ce)定÷(ΔA 標準 2÷C 標)×V 提取÷W=1.25×ΔA 測(ce)定÷ΔA 標準 2÷W (3)按(an)細菌(jun)或(huo)細胞(bao)密度計算 NADH (nmol/10 4cell)=ΔA 測(ce)定÷(ΔA 標(biao)(biao)準(zhun) 2÷C 標(biao)(biao))×V 提(ti)取(qu)÷500=0.0025×ΔA 測(ce)定÷ΔA 標(biao)(biao)準(zhun) 2 C 標(biao)(biao):NAD 或 NADH 標(biao)(biao)準(zhun)溶液(ye)的濃度,1.25nmol/mL;V 提(ti)取(qu):加入提(ti)取(qu)液(ye)總體(ti)積,1mL;V 血清:提(ti)取(qu)時加入的血清體(ti)積,0.1mL;W:樣本(ben)鮮(xian)重,g;500:500 萬個細胞。 生化法 輔酶ⅠNAD(H)含量檢測試劑盒 |